食源性致病菌檢測技術（4）

 霍亂弧菌

    霍亂弧菌（V.cholerae）汙染食品，可引起食源性疾病的暴發。主要表現為劇 烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚高。屬於國際檢疫傳染病。  

1．常規和快速檢驗技術

    劇烈腹瀉病人的水樣便可直接分離在慶大黴素、4號瓊脂、或TCBS、弧菌瓊脂等平板上，36℃培養10-20小時，挑取可疑菌落與霍亂多價血清作玻片凝集試驗和生化鑒定。恢複期病人，帶菌者或用過抗菌藥的病人糞便、肛拭、食品與其它環境標本（如水、蒼蠅、昆蟲等）必須增菌後分離，獲得純培養物進行各項試驗進行菌種的鑒定。方法見中華人民共和國衛生部《霍亂防治手冊》1987年。 

2．快速輔助診斷

    製動試驗：取急性病人水樣糞便一滴於玻片上，直接用顯微鏡觀察，可見到具有流星狀動力的細菌，然後加上一滴霍亂免疫血清後，運動停止，凝結成塊，即可初步診斷為霍亂弧菌。  

    早期玻片凝集法：挑取慶大黴素瓊脂平板較大菌落直接與霍亂多價診斷血清作玻片凝集試驗，凝集者既可初步報告陽性。  

    免疫熒光菌球菌法：將增菌培養物接種於含有霍亂熒光抗體的蛋白腖水中，37℃培養4-6小時，在熒光顯微鏡下可觀察到呈現熒光菌球者，即為菌球陽性。也可將標本與熒光抗體混合後離心取沉澱物塗片在顯微鏡下觀察，同樣呈現熒光菌球者，即為菌球陽性。此方法適合於外環境標本的檢驗。  

    SPA協同凝集試驗：將菌培養液與SPA診斷試劑作玻片凝集試驗，出現（++）凝集時，將該培養液煮沸再作一次凝集，如仍出現（++）凝集時，可作初步陽性報告，同時可將未經加熱的凝集塊進行分離培養。  

3．流行病學分型技術

生物型的鑒別

    第Ⅳ組噬菌體（106/毫升）裂解試驗：第Ⅳ組霍亂噬菌體常規稀釋液（106/毫升）一般隻裂解霍亂弧菌古典型，而不裂解埃爾托型（有少數例外）。第Ⅳ組霍亂噬菌體原液（109/毫升）對古典型、埃爾托型均能裂解。 

    多粘菌素B敏感試驗：在冷卻至約50℃的普通瓊脂中加入多粘菌素B（50單位/毫升），混合後製成平板。然後將2-3小時的菌培養物一環接種在平板。然後將2-3小時的菌培養物一環接種在平板表麵，待幹後置37℃培養過夜，觀察結果。古典型敏感（不生長或生長不足10個菌落），埃爾托不敏感（多粘菌株形成菌苔）。也可用多粘菌素B紙片（50單位）按藥敏感試驗方法進行。  

    雞血球凝集試驗：加一滴生理鹽水於玻片上，挑取被檢菌培養物於鹽水中製成濃厚的菌懸液，取一滴2.5%雞血球懸液混於菌懸液中,搖勻,一分鍾內出現血球凝集者為陽性,血球呈均勻分散狀態為陰性。埃爾托型為陽性，古典型一般為陰性。  

    ＶＰ試驗：將被檢菌接種於葡萄糖磷酸鹽蛋白腖水中，於３７℃培養２－３天後，取出１毫升加５％α－奈酚酒精溶液０．６毫升，震蕩５秒鍾，再加入４０％氫氧化鉀０．２毫升，再震蕩５秒鍾，於室溫中放置２－５分鍾，１小時內出現紅色者為陽性。古典型為陰性，埃爾托型多為陽性。

噬菌體、生物分型：為區別埃爾托型的兩類不同菌株（流行株與非流行株）和不同菌型，對不同來源的菌株進行分型，可追溯病原的來源。  

    噬菌體分型：根據５株噬菌體（ＶＰ１－ＶＰ５）可將埃爾托弧菌分成３２個噬菌體型，常見的流行株為噬菌體１型（對５株噬菌體型全敏感）、３～５型，２型主要是１型的粗糙型，６型以後屬非流行株。

埃爾托弧菌生物分型：根據菌株的溶原性、對溶原噬菌體的敏感性、山梨醇發酵和溶血試驗等生物學性狀可將埃爾托弧菌分成１２個生物型。  

    噬菌體－生物分型：將噬菌體分型與生物分型結合起來，每個噬菌體又可分為幾個生物型，即噬菌體－生物分型，如１ａ、１ｂ、８ｉ等。常見的流行株為噬菌體１～３型，生物型為ａ～ｄ，非流行株為噬菌體６～３２型，生物型為ｇ～ｌ。通過噬菌體－生物分型，可以了解該地區菌型組成和分布情況。 

４．血清學診斷

    多數病人在發病第５天（早的第３天）即出現抗體(凝集素、殺弧菌抗體)和抗毒抗體。抗體滴度在發病第８～２１天之間達高峰，而多數病人的高峰在１０～15天之間，並在三周後滴度開始下降。  

    殺弧菌抗體檢測：多數采用平皿溶菌法、試管法和改良微量法。方法見中華人民共和國衛生部《霍亂防治手冊》1987年。  

    抗毒抗體測定：多數采用ELISA法、反向被動血凝法、皮膚血滲透因子中和法等。我國一般都采用ELISA法測定霍亂抗毒抗體。方法見中華人民共和國衛生部《霍亂防治手冊》1987年。

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