常見食源性致病菌的革蘭氏染色觀察

一、革蘭氏染色液成分及原理

  革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法。未經染色之細菌，由於其與周圍環境折光率差別甚小，故在顯微鏡下極難觀察。染色後細菌與環境形成鮮明對比，可以清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些結構特征，而用以分類鑒定。

  革蘭氏陽性菌的細胞壁主要有90%的肽聚糖和10%的磷壁酸組成，幾乎不含類脂質，厚度20-80nm。革蘭氏陰性菌的細胞壁主要由肽聚糖、脂多糖構成，厚度約10-15nm。結晶紫初染和碘液媒染後，在菌體內形成了不溶於水的大分子複合物，在使用乙醇脫色時，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，失水網孔縮小，把結晶紫與碘複合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；革蘭氏陰性菌其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑後，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而鬆散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘複合物的溶出，因此通過乙醇脫色後仍呈無色，再經沙黃等紅色染料複染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

二、操作步驟

  1.塗片：在載玻片上滴少量純化水，用接種環挑取少量菌苔塗開，自然幹燥或微熱幹燥，再經火焰2-3次固定。

  2.初染：加（結晶紫溶液）溶液A染1分鍾，用清水衝去染液。

  3.媒染：加（碘液）溶液B染1分鍾，水洗。

  4.脫色：加（95%乙醇）溶液C，不時搖動玻片約10-30秒，至無紫色脫落為止，水洗。

  5.複染：加（沙黃複染液）溶液D，染1分鍾，水洗。

  6.觀察：用濾紙吸水晾幹後油鏡鏡檢。陽性菌呈紫色、陰性菌呈紅色。

三、注意事項

  （1）塗片時挑取菌量不宜過多，塗片不宜過厚，否則可能導致染色不完全或脫色不完全。

  （2）脫色是革蘭氏染色操作中至關重要的一步，脫色時間要把握準確。脫色過度易導致革蘭氏陽性菌染成紅色，脫色不足易導致革蘭氏陰性菌染成紫色。

  （3）革蘭氏染色宜選用細菌新鮮培養物。一些革蘭氏陽性菌在培養時間過長後易出現老化現象，細胞壁發生改變，導致染色結果發生變化。

  （4）並不是所有革蘭氏陽性菌都會染成紫色，革蘭氏陰性菌都會染成紅色。一些細菌的細胞壁構成比較特殊或易發生改變，染色時會觀察到相反的結果。

四、染色結果觀察

  （1）大腸埃希氏菌O157和普通大腸埃希氏菌、沙門氏菌為革蘭氏陰菌，鏡檢形態為紅色短杆菌。

大腸埃希氏菌O157:H7 ATCC35150	大腸埃希氏菌ATCC25922	鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028

  （2）誌賀氏菌為革蘭氏陰性短杆菌

福氏誌賀氏菌ATCC12022	宋內誌賀氏菌ATCC25931	痢疾誌賀氏菌CMCC51252

  （3）產氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性梭杆菌，有時可見菌體內膨大不著色的芽孢結構；單增李斯特氏菌為革蘭氏陽性無芽孢短杆菌；蠟樣芽胞杆菌為革蘭氏陽性芽孢長杆菌，常呈鏈狀排列，菌體內或外有時可見不著色的橢圓形芽孢。

產氣莢膜梭菌ATCC13124	單增李斯特氏菌ATCC19114	蠟樣芽胞杆菌ATCC11778

  （4）金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，常呈葡萄狀堆積排列；副溶血性弧菌為革蘭氏陰性杆菌，菌體略有彎曲呈弧狀；唐菖蒲伯克霍爾德氏菌氏菌為革蘭氏陰性杆菌。

金黃色葡萄球菌ATCC25923	副溶血性弧菌ATCC17802	唐菖蒲伯克霍爾德氏菌CICC10574

  （5）普通變形杆菌、奇異變形杆菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌為革蘭氏陰性杆菌。

普通變形杆菌CMCC49027	奇異變形杆菌CMCC49005	小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC52204

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