5 聚酮類抗生素的MBS研究
5.1 Rapamycin（雷帕黴素）［20～23］
Rapamycin是由吸水鏈黴菌（Streptomyces hygro-scopicus）NRRL5491產生的31元大環內酯類免疫抑製劑，結構與FK506（tacrolimus，他克莫司）和immunomycin相似（Fig.8）。臨床上主要用於自身免疫病和組織器官移植時產生的排異反應的治療。
來源於L-賴氨酸的六氫吡啶酸是rapamycin聚酮環的重要組成結構。研究表明，rapL基因編碼的RapL（賴氨酸環化脫氨酶）催化L-賴氨酸生成L-六氫吡啶羧酸。
1998年，Khaw等通過ΦC31噬菌體介導的基因置換使rapL產生移碼突變，構建了RapL失活突變株LEK111。當用TSBGM完全培養基發酵培養野生型菌時，產生rapamycin和prolylrapamycin（脯氨酰雷帕黴素，L-脯氨酸取代L-六氫吡啶羧酸），兩者比例約為20∶1;同樣條件下發酵LEK111，則產生少量rapamy-cin和prolylrapamycin，且prolylrapamycin的相對含量大大增加;添加L-六氫吡啶羧酸，產生rapamycin的量和野生型菌株幾乎相當;添加L-反-4-羥脯氨酸，產生兩種新的rapamycin類似物［4-羥脯氨酰-26-去甲氧基-rapamycin（4-hydroxyprolyl-26-demethoxy-ra- pamycin）和4-羥脯氨酰rapamycin（4-hydroxyprolyl- rapamycin）］;L-順-4-羥脯氨酸、L-順-3-羥脯氨酸也可以摻入到rapamycin中，但新物質結構未闡明;3，4-雙羥脯氨酸和吡啶羧酸未能摻入到rapamycin中。體外活性順序為rapamycin>脯氨酰rapamycin>4-羥脯氨酰-26-去甲氧基-rapamycin。
2001年，Chung等通過同源雙雜交技術，獲得一個rapamycin基因簇rapQONML被破壞的突變株，在添加六氫吡啶羧酸後，生成16-氧-去甲基-27-去甲氧基rapamycin，而非rapamycin。
2003年，Graziani等添加RapL的抑製物到野生型菌的發酵液中，進行類似MBS的研究，在添加噻嗪烷羧酸後，生成了含硫的rapamycin類似物。
Gregory等也曾采用基因手段對rapamycin產生菌進行MBS研究［23］ 。
5.2 Enterocin（伏爾加黴素，恩特洛黴素）［24］ Enterocin和wailupemycin是由Streptomyces maritimus產生的結構相似的抑菌劑，其生物合成途徑如Fig.9所示。由encP基因編碼的苯丙氨酸氨基裂合酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）對entero-cin和wailupemycin的起始前體苯甲酰CoA的合成起著決定性作用。
2003年，Kalaitzis等通過同源雙雜交技術，刪除了442bp的EncP序列，構建了PAL失活的S.mari-timus突變株XP。添加芳香酸（包括單取代苯甲酸、雜環芳香酸、1-烯-環己烷甲酸），發現單取代苯甲酸中，隻有對-氟苯甲酸可被利用，生成20-氟代enterocin、5-脫氧-20-氟代enterocin和19-氟代wailupemycin D～G;2-噻吩甲酸和3-噻吩甲酸以近似1∶2的比例摻入到enterocin和wailupemycin類似物分子中，但雜環化合物如呋喃酸（糖酸）、煙酸未能摻入;添加1-烯-環己烷甲酸，隻生成了enterocin類似物;添加N-乙酰半胱氨酸（NAC）基礎上改造而來的芳香酰CoA硫酯的模擬物，隻有苯甲酰-SNAC和2-噻吩甲酰-SNAC以很低的效率摻入到enterocin和wailupemycin G的分子中，而對-甲苯酰-SNAC和對-氯-苯甲酰-SNAC未被利用。這是Kalaitzis等第一次利用MBS技術對PKSⅡ型的大環內酯抗生素進行結構改造的研究。上述實驗數據說明Ⅱ型PKSs對外源起始單元的耐受性相對較低，具體的機製還有待進一步的研究。
5.3 Erythromycin（紅黴素）［25］
紅黴素是1952年從紅黴素鏈黴菌（Streptomyceserythreus）培養液中分離出來的堿性大環內酯類抗生 素，有A、B、C、D、E等組分。紅黴素分子包括三部分:紅黴素內酯（erythronolide）、去氧氨基己糖（desosa-mine）和紅黴糖（cladinose）。
6-dEB（6-脫氧紅黴素內酯）是紅黴素合成途徑中最早的中間體，在羥化酶的作用下，C-6位羥基化形成紅黴素內酯參與生物合成。早期曾獲得不能合成6-dEB的突變株2NU153，添加一係列的紅黴素內酯類似物，合成了許多新的衍生物2］ 。6-dEB是在聚酮合成酶（polyketide synthases）DEBS催化作用下，由丙酰-CoA和六個甲基丙二酰-CoA以類似脂肪酸合成的途徑生成的。DEBS包括三個亞基:DEBS1、DEBS2和DEBS3，每個亞基包含兩個模塊，其中DEBS1還包含荷載域（loading domain），DEBS3還包含一個硫酯酶TE;Pieper等研究表明DEBS1的荷載域對底物的特異性有較大的寬容性，除正常的丙酰-CoA外，還可以接受乙酰-CoA、丁酰-CoA和N-乙酰半胱氨酸（SNAC）硫酯等。Khosla等1997年通過分子手段使DEBS1酮基縮合酶失活，並構建質粒p JRJ2 ，通過質粒將6-dEB基因轉移到異源宿主天藍色鏈黴菌（Strep-tomyces coelicolor）中，獲得工程菌CH999。添加SNAC-硫酯類似物，修複6-dEB的生產能力，並形成新衍生物。然後將這些新衍生物添加到Streptomyces erythreus發酵液中，通過生物轉化作用，合成一係列erythromycin D的類似物（Fig.10）。研究發現，SNAC的穩定性和添加時間直接影響到MBS的成功與否及新衍生物的產量。
目前，對紅黴素生物合成途徑和基因簇的研究已經比較透徹，為合成新的衍生物提供了重要基礎和有利條件。
5.4 Avermectin［26～32］ Avermectins（AVM）是由除蟲鏈黴菌（Strepto-mycin avermitilis）產生的具有殺昆蟲、殺蟎、殺線蟲活性的16元大環內酯類抗生素，結構如Fig.11所示。AVM分子主要由兩部分（十六元大環內酯環和L-齊墩果糖二糖）組成，根據C5、C22-23、C26位結構的不八個組分。AVM的起始單元來自L-Ile和L-Val，它們在支鏈氨基酸轉氨酶的作用下生成α-酮酸，然後在支鏈氨基酸α-酮酸脫氫酶BCDH的作用下分別生成2-甲基-丁酰-CoA和異丁酰-CoA。在此基礎上，進一步合成AVM a和b。早在1986年Bu′Lock等就通過誘變獲得BCDH失活的突變株，利用MBS技術對AVM C25位上的結構進行改造。1991年，Hafne等詳細介紹了采用NTG誘變獲得BCDH失活突變株的過程，並獲得性能穩定的突變株ATCC53568。之後，Dutton和Bu′Lock等利用ATCC53568進行了係統的MBS研究，添加800多種突變生物合成元，獲得了36種新衍生物，均表現出很好的生物活性。其中，最重要的一個衍生物就是多拉克汀（doramectin），它被認為是采用MBS技術合成的AVM家族中最優秀的成員。多拉克汀是在發酵培養BCDH失活突變株的過程中添加環己烷羧酸（cyclohexanecarboxylic acid，CHC）獲得的。因為BCDH失活，不能利用L-Ile和L-Val為起始單元合成正常的AVM，CHC在脂酰-CoA合成酶的作用下，參與到新起始單元的合成。其結構如Fig.11所示，環己烷取代C25位上的原有結構。多拉克汀抗蟲譜廣、活性強，為極具開發潛力的抗蟲新藥。
1995年，Skinner等分別對BCDH的兩個基因（bkdABC和bkdFGH）進行研究，發現F基因中斷，添加2-甲基丁酸，隻產生a組分。添加環己烷羧酸合成多拉克汀。
2000年，Croop等從S.collinus中克隆到一個能夠合成環己烷甲酸-CoA的基因，並成功地將該基因導入Streptomycin avermitilis bkd突變株中，使合成的環己烷脂肪酸占總脂肪酸的49%。這樣，在不添加環己烷甲酸的情況下也能產生多拉克汀。隨後，Stutz- man-Engwall等通過插入失活、定點突變和錯配PCR 等技術使aveC失活，獲得CHC-B1 （多拉克汀）與CHC-B2 的比例增大4倍的突變株。經過上述改造獲得的工程菌，其多拉克汀的產量大大提高，並應用於工業生產。
6 Siderophore的MBS研究［33］
Siderophore是微生物產生的一類低分子量的Fe離子螯合劑，具有很強的Fe離子親和力，滿足微生物對鐵元素的需要。Phenolic是siderophore家族重要的成員之一，是由銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerugi-nosa）產生的酚代side-rophore。水楊酸（salicylic acid）是phenolic生物合成的關鍵中間體。
1991年，Ankenbauer等構建了水楊酸合成阻斷突變體Sal-IA602。Ankenbauer等添加13種水楊酸類似物到IA602的發酵液中，發現其中隻有5-氟水楊酸（5-fluorosalicylic acid）、4-甲基水楊酸（4-methylsali-cylic acid）和3-羥基吡啶甲酸（3-hydroxypicolinic acid）可摻入到pyochelin類似物的生物合成中，並相應的生成5-氟pyochelin、4-甲基pyochelin和6-aza-pyochelin（Fig.12）。活性研究表明，三者都具有Fe離子運輸活性，活性順序為4-甲基pyochelin>Phenolic>6-azapyochelin>5-fluoro-pyochelin。
7 討論
突變生物合成是在研究抗生素次級代謝途徑的過程中興起、發展和完善起來的。最初在氨基糖苷類抗生素中得到廣泛應用。到目前為止，幾乎涉及到抗生素的各個類別，特別是氨基糖苷類、聚酮類和多肽類，開發了許多優秀品種，如2-羥基慶大黴素、N-乙酰西索米星、多拉克汀和依替米星等。同時，也在非抗生素領域得到應用，如對siderophore和rapamycin衍生物的研究。
MBS的發展很大程度上決定於突變株的檢出，在分子生物學技術應用於MBS以前，主要靠化學、物理誘變來獲得突變株，這種方法具有很大的隨機性，而且工作量大，限製了其發展。基因技術的發展使突變株的獲得方式發生了巨大變化:直接改造藥物的生物合成基因，有目的性和針對性地獲得突變株。新階段MBS研究的發展還得益於以下幾個方麵:①微生物次級代謝途徑和基因簇研究的深入;②現代分離檢測方法特別是HPLC-MS的應用;③突變合成元來源的擴大;④酶工程的發展。
作為產生微生物藥物衍生物的重要手段，MBS有著巨大的發展潛力，主要體現在:①與半合成相比，汙染少、成本低，而且有些衍生物不能通過化學方法製備;②新衍生物的發酵工藝、提取工藝、所需設備等與原品種相似或相近，甚至稍做改動便可實現工業化生產，具有很好的經濟效益和社會效益;③微生物次級代謝途徑和基因簇研究的深入，為MBS提供了更多的研究對象。
MBS技術更廣泛地應用存在一些限製因素如:①盡管利用基因技術可以有目的的獲得所需要的突變株，但由於酶的專一性，使得突變合成元的選擇範圍受到很大限製;②摻入量有限，給新衍生物的檢測、分離和工業化增加了難度。針對這些問題，需要對產生菌進一步改造、對發酵條件進行優化、對提取分離檢測方法進行改進。
MBS本身也存在一定的局限性，即MBS主要是對微生物藥物的母體結構進行改造，為藥物結構類似物的研究製備方法。
盡管MBS技術還存在這樣那樣的問題，許多優秀的衍生物品種，特別是多拉克汀的開發成功，無疑預示著其巨大的潛力。
作者：白寶星 張春燕 田敏 朱輝
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