一、目的
學習和掌握篩選營養缺陷型突變株的原理及方法。
二、原理
營養缺陷型是指野生型菌株由於基因突變，致使細胞合成途徑出現某些缺陷，喪失合成某些物質的能力，因而必須在基本培養基中補加該營養物質才能正常生長的一類突變菌株。由於減低或消除了末端產物濃度，可解除反饋代謝調控，使代謝途徑中間產物或分枝合成途徑中末端產物得以積累。所以營養缺陷型菌株被廣泛用於氨基酸、核苷酸、維生素的生產中，也廣泛用於基因定位、雜交及基因重組等研究中的遺傳標記。
三、材料
1.菌種 枯草杆菌（B.subtilis）。
2.培養基
(1)細菌完全培養基(CM)。
(2)細基本培養基（MM）
(3)無氮基本培養基（基本培養棊中不加(NH4)SO4和瓊脂）。
(4)2倍氮源基本培養基〔基本培養基中加入2倍(NH4)SO4，不加瓊脂〕
(5)限製培養基（SM）（液體基本培養基中加入0.1%~0.5%的完全培養基和2%瓊脂）。
3.溶液
(1)無維生素的酪素水解物或氮基酸混合液。
(2)水溶性維生索混合液。
(3)核酸（RNA）水解液 製作法：取2gRNA，加入15ml 1mol/L NaOH; 另取2gRNA,加入15ml 1mol/L HCL，分別於100℃水浴加熱水解20min後混合，調整pH為6.0,過濾後調整體積為40ml。
4.設備及器皿 誘變箱、離心機、直徑90mm培養皿，250ml三角瓶。
四、方法與步驟
1.出發菌株 取新活化的枯草杆菌斜麵菌種1環，加人裝有20ml完全培養基的
250ml三角瓶中， 30℃振蕩培養16~18h，取1ml培養液轉接於另一隻裝有20ml完全培養基的250ml三角瓶中， 30℃振蕩培養6h，使細胞處於對數生長狀態。
2.細胞懸液的製備
（1）取10ml培養液，離心3500r/min,10min)收集菌體，用生理鹽水離心洗滌2
次，而後將菌體充分懸浮於11ml生理鹽水中，調整細胞濃度為108個/ml。
（2）以活菌計數法測定細胞懸液濃度。
3.誘變處理 取10ml處理菌液於直徑90mm培養皿中（帶磁棒〉，用紫外線照射60s 。4.中間培養 取1ml處理菌液轉人裝有20ml液體完全培養基的250ml三角瓶中，30℃振蕩培養過夜。
五、淘汰野生型(青黴素法〉
（1）取10ml中間培養液，離心（3500r/min,10min）收集菌體，用生理鹽水離心洗滌2次，之後將菌體轉入10ml無氮基本培養基中，30℃振蕩培養6~8h（饑餓培養）。
（2）將全部菌液轉入10ml 2倍氮源基本培養中，30℃振蕩培養1〜2h加入終濃度為
100u/ml的青黴素（母液濃度為2000u/ml）繼續培養5〜6h殺死野生型細胞，濃縮缺陷型細胞。
（3）取10ml菌液，離心收集菌體，用生理鹽水離心洗滌-次，而後將菌體充分懸浮於10ml生理鹽水中。
六、營養缺陷型菌株的檢出（逐個檢出法〉
（1）取0.1ml菌懸液，塗布於限製培養基平板上|（3個平板以上〕，30℃培養48h,野生型形成大菌落，缺陷型為小菌落。
（2）製備完全培養基和基本培養基平板各4個，並在皿的背麵劃好方格〔毎皿以30個格左右為好〕
（3）用牙簽從限製培養基平板上逐個挑取小菌落，對應點接在基本培養基平板和完全
培養基平板上（先點接似MM平板，後點接CM平板）。30℃培養48h將在完全培養基平板生長，而在基本培養基平板上相對應位置上不生長的菌落，接入完全培養基斜麵，30℃培養24h作為營養缺陷型鑒定用菌株。
七、營養缺陷型菌株的鑒定
（1）取待測菌株斜麵1環接於5ml生理鹽水中，充分混勻，離心收集菌體，然後，將菌體充分懸浮於5ml生理鹽水中。
（2）取1ml菌懸液與平皿中，傾入約15ml融化並冷卻至45~50℃的基本培養基，製成待測平板。
（3）將待測平板背麵劃分成3個區域，在平板表麵3個區域分別貼上蘸有氨基酸混合液，維生素混合液，核酸水解液的濾紙片，30℃培養24h。觀察濾紙片周圍菌落生長情況。在濾紙片周圍生長的菌株，即為相應的營養缺陷型菌株。
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