標準依據：《GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測》
1 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下。
1.1 恒溫厭氧培養箱:37℃±1℃。
1.2 冰箱:2℃～5℃。
1.3 恒溫水浴箱:80℃±1℃.
1.4 天平:感量為0.1g。
1.5 均質器及無菌均質袋,均質杯。
1.6 振蕩器。
1.7 無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度),10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。
1.8 無菌錐形瓶:容量250mL、500mL。
1.9 無菌培養皿:直徑90mm。
1.10 顯微鏡:10倍一100倍。
1.11 pH計或pH比色管或精密pH試紙。
2 培養基和試劑
2.1 營養瓊脂培養基。
2.2 營養肉湯培養基。
2.3 無菌生理鹽水。
2.4 革蘭氏染色液。
2.5 細菌生化鑒定試劑盒。
3 檢驗程序
枯草芽孢杆菌的檢驗程序見下圖。
4 操作步驟
4.1 樣品製備
4.1.1 固體和半固體樣品
稱取25g樣品，置於225mL生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打lmin～2min製成1：10的樣品勻液；或置於盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質杯中,8000r/min～10000r/min均質lmin～2min製成1：10的樣品勻液。
4.1.2 液體樣品
應先將其充分搖勻後,以無菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)中,充分振搖﹐製成1：10的樣品勻液。
4.2 樣品稀釋
4.2.1 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取l：10樣品勻液lmL,沿管壁緩慢注於裝有9mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反複吹打使其混合均勻,製成l:100的樣品勻液。
4.2.2 另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭,按上述操作順序,做10倍遞增樣品勻液,每遞增稀釋一次,即換用1次lml滅菌吸管或吸頭。
4.3 培養
根據對待檢樣品菌含量的估計,選擇2個～3個連續的適宜稀釋度﹐每個稀釋度水浴80℃±l℃維持10min,吸取菌液0.2mL接種於營養瓊脂平板內,使用塗布棒盡可能小心快速地塗布接種液於瓊脂表麵,塗布棒不得接觸平皿邊緣。每個稀釋度接種2個平板。塗布後,將平板靜置10min使接種物完全被培養基吸收。翻轉平皿置於37℃±1℃厭氧培養箱中培養48h±2h。
4.4 菌落計數
4.4.1 選取特征菌落數在20CFU～200CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低於20 CFU的平板記錄具體菌落數,大於200 CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。
4.4.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半,而其餘一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個平板後乘以2,代表一個平板菌落數。
4.4.3 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時,則將每條單鏈作為一個菌落計數。
4.5 鑒定
4.5.1 菌落挑選和純培養
挑選平板上5個表麵粗糙、不透明，灰色或微黃色的菌落分別轉入營養肉湯培養基37℃±1℃厭氧培養箱中培養24h土2h後進行形態學、生化鑒定。
4.5.2 形態學鑒定
革蘭氏染色,鏡檢。枯草芽孢杆菌為革蘭氏陽性杆菌,呈杆狀,兩端圓,長度1.5u.m～3.0um,無莢膜,周生鞭毛,有芽孢，芽孢橢圓形，中生或近中生，芽孢囊不明顯膨大。
4.5.3 生化鑒定
使用細菌生化鑒定試劑盒進行生化鑒定。菌鑒別特征參見表B.3。
5 結果計算
5.1 每個平板中枯草芽孢杆菌的數量
每個平板中枯草芽孢杆菌菌落數的計算見式(1):
a=b/A×C ...............（1）
式中
a-每塊平板上的枯草芽孢杆菌菌落數;
b-挑取後經證實為枯草芽孢杆菌的菌落數;
A-挑取平板上用於驗證的菌落數;
C-平板上的所有特征菌落數。
5.2 菌落總數的計算方法
5.2.1 若隻有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數範圍內,計算兩個平板中枯草芽孢杆菌菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每克(毫升)中菌落總數結果。
5.2.2 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數範圍內時,按式(2)計算:
N=∑C/（n1+0.1n2）×d ...............（2）
式中:
N-樣品中菌落數;
∑C-平板(含適宜範圍菌落數的平板)菌落數之和;
n1-第一稀釋度(低稀釋倍數)平板個數;
n2-第二稀釋度(高稀釋倍數)平板個數;
d-稀釋因子(第一稀釋度)。
6 報告
6.1 結果判定
若樣品菌落符合枯草芽孢杆菌形態學及生化鑒定的特征，可判定為枯草芽孢杆菌。
6.2 結果報告
6.2.1 定性報告
在25g(mL)樣品中檢出或未檢出枯草芽孢杆菌。
6.2.2 定量報告
菌落數小於100CFU時，以整數報告。菌落數大於或等於100CFU時,對第3位數字進行修約後，取前2位數字,後麵用0代替位數；也可用10的指數形式來表示,采用兩位有效數字。
本文節選自《GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測》。
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