1.以無菌操作方式開啟菌種管,加入適量營養肉湯培養基,吹吸數次,使菌種融化分散。取含5.0 mL~10.0 mL營養肉湯培養基試管,滴入少許菌種懸液,置36 ℃±1 ℃培養18 h~24 h。用接種環取第1代培養的菌懸液,劃線接種於營養瓊脂培養基平板上,置36 ℃±1 ℃培養18 h~24 h。挑取上述第2代培養物中典型菌落,接種於營養肉湯培養基,置36 ℃±1 ℃培養18 h~24 h,即為第3代培養物。
2.用10.0 mL吸管吸取5.0 mL~10.0 mL第3代~5代的18 h~24 h營養肉湯培養物,接種於羅氏瓶(或細胞培養瓶)營養瓊脂培養基表麵,將其搖動使菌液布滿培養基表麵,將多餘肉湯培養物吸出,羅氏瓶(或細胞培養瓶)置36 ℃±1 ℃恒溫培養箱內培養5 d~7 d。
3.用接種環取少許菌苔塗於玻片上,以改良芽胞染色法染色。改良芽胞染色法:用接種環取菌苔塗於玻片上,自然幹燥後,通過火焰加熱將菌固定於玻片上;將塗片放入平皿內,片上放兩層濾紙,滴加足量的5.0%孔雀綠水溶液,將平皿蓋好,置55 ℃±1 ℃加熱30 min。取出,去濾紙,用自來水衝去殘留液;加0.5%沙黃水溶液,1 min後水洗,待幹後鏡檢。芽胞呈綠色,菌體呈紅色。在顯微鏡(油鏡)下鏡檢,當芽胞形成率達90%以上時,即可進行以下處理。否則,繼續在室溫下放置一定時間,直至達到上述芽胞形成率後再進行以下處理。
4.加10.0 mL無菌蒸餾水於羅氏瓶(或細胞培養瓶)中,以L棒輕輕刮下菌苔,吸出,再加入5.0 mL無菌蒸餾水衝洗培養基表麵,吸出。將兩次吸出的菌懸液集中於含玻璃珠的無菌錐形燒瓶中,振搖5 min。
5.將燒瓶置45 ℃水浴24 h,使菌自溶斷鏈,分散成單個芽胞。
6.用無菌棉花或紗布過濾芽胞懸液,清除瓊脂凝塊。
7.將芽胞懸液置無菌離心管內,以3000 r/min速度離心30 min。棄上清液,加蒸餾水吹吸使芽胞重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗,本步驟重複進行3遍。
8.將洗淨的芽胞懸液放入含適量小玻璃珠的燒瓶內,80 ℃水浴10 min(或60 ℃水浴30 min),以殺滅殘餘的細菌繁殖體。待冷至室溫後,搖勻分裝後冷藏保存備用,有效使用期6個月。
9.芽胞懸液在使用時,先進行活菌培養計數。
10.懷疑有汙染時,以菌落形態、革蘭染色與生化試驗等方法進行鑒定。
本文節選自中華人民共和國衛生行業標準《WS/T 683—2020消毒試驗用微生物要求》。
上一篇:菌種的複蘇與傳代
下一篇:粘球菌屬中種的描述之變綠色粘球菌