1、緩衝液和溶液:
SM
氯仿
2、培養基:
NZCYM
3、載體和菌株:
高滴度的λ噬菌體原種
4、離心機和轉子:
Sorvall SS-34或相當型號
5、專用設備:略
二、方法:
1、 接種大腸杆菌適宜菌株的單菌落至分裝在500ml錐形瓶的100mlNZCYM中,37℃劇烈振蕩培養過夜。
2、 測定培養物的OD600值,以1OD600=1×109個細胞/ml計算細胞濃度.
3、 取4份樣品,每份含1010個細胞,4000g(5800r/min 於Sorvall SS-34)室溫離心10min,去上清。
4、 將每份細菌沉澱用3ml SM懸浮。
5、 加入適當數量的感染性噬菌體顆粒,振蕩使噬菌體充分分散於整個培養物中。
6、 將感染培養物37℃溫育20min,間或搖晃。
7、 將每份感染樣品加入到預熱至37℃的500ml NZCYM(於2L 燒瓶中),37℃劇烈振蕩培養(300r/min).
8、 8h後開始監視培養物的裂解情況。伴隨著細菌和噬菌體的生長,8-12h後裂解發生,如果觀察大裂解發生,轉入步驟10.
9、 假如12h後裂解不明顯,取小量培養物樣品,檢查噬菌體的生長情況。
a. 取兩份感染培養物樣品(每份1ml)至玻璃試管中。
b. 每管中加入1至2滴氯仿(約50-100ml),37℃培養5-10min,間或搖晃。
c. 將每管置光線下比較培養物的外觀。如果接近完全感染但細胞還沒有裂解,氯仿將導致細胞破裂,從而使混濁的培養物變為透明。在這種情況下,轉入步驟10.
10、每個燒瓶中加入10ml氯仿,37℃繼續振蕩培養10min。
11、將培養物冷卻至室溫,隨之用方案6所述沉澱噬菌體顆粒。
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