從大規模裂解物中製備λ噬菌體顆粒
錄入時間:2011-9-23 16:26:18
來源：生物在線
一、材料：
1、緩衝液和溶液：
氯仿
NaCl（固體）
聚乙二醇（PEG 8000）
SM
2、酶和緩衝液：
胰Dnase I (1mg/ml)
胰Dnase I (1mg/ml)於TE中（ph7.6）
3、離心機和轉子：
Sorvall GSA 轉子或相當型號
4、專用設備：
量筒（2L）
載體和菌株：
大腸杆菌培養物，經λ噬菌體感染和裂解
二、方法：
用PEG沉澱噬菌體顆粒
1、 將含有λ噬菌體的裂解培養物冷卻至室溫，加胰Dnase I和Dnase 至終濃度約為1ug/ml，室溫溫育30min。
2、 每500ml培養物加入29.2固體NaCl（終濃度為1mon/L），攪拌使其溶解。將培養物冰浴1h。
3、 4℃，11000g（8300r/min於Sorvall GSA轉子中）離心10min以去除細胞碎片，將四份培養物的上清混合置於2L的幹淨量筒中。
4、 測定所收集上清的總體積，然後轉移至2L的燒瓶中，加固體PEG至終濃度為10%（m/V，加500ml上清加50gPEG），於室溫用磁力攪拌器慢慢攪拌溶解PEG。
5、 將噬菌體/PEG溶液轉移至聚丙烯離心管中，於冰水浴冷卻，至少放置1h以便使噬菌體顆粒發生沉澱。
6、 4℃，11000g（8300r/min於Sorvall GSA轉子中）離心10min以回收沉澱的噬菌體，去上清，將離心管倒過來傾斜放置5min，以便是剩餘液體充分流幹。用移液器吸取殘餘的液體。
用氯仿抽提細菌碎片：
7、 用一帶橡皮球的寬口吸幹將噬菌體沉澱輕輕地重懸於SM中（針對步驟3每500ml上清加8ml SM），將離心管傾斜放置，使SM完全覆蓋並浸泡噬菌體沉澱，室溫放置1h。
通過加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的PEG和細胞碎片，溫和振蕩30s。4℃，3000g（4300r/min於Sorvall GSA轉子中）離心15min以分離有機相和親水相，回收含噬菌體顆粒的親水相。
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