λ噬菌體DNA提取

λ噬菌體是最早使用的克隆載體，λ噬菌體的基因組是一長度約為50kb的雙鏈DNA分子，它在宿主細胞有兩種生活途徑：其一是裂解生長，環狀DNA 分子在細胞內多次複製，合成大量噬菌體基因產物，裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌再進行下一次感染；其二是溶源性生長，即感染細胞內λ噬菌體DNA整合到宿主菌染色體DNA中與之一起複製，並遺傳給子代細胞，宿主細胞不裂解。平板培養時，裂解生長形成噬斑。液體培養時，裂解生長使菌液中宿主菌最後全部被裂解而釋放出大量的噬菌體顆粒。

經過改造的λ噬菌體克隆位點可插入幾到幾十kb的外源DNA。許多cDNA和基因組文庫是以λ噬菌體作為克隆載體構建的。因此，在經文庫篩選得到目的克隆後，我們常常需要利用λ噬菌體裂解生長的特點，培養獲得大量的噬菌體顆粒，並提取λ噬菌體DNA來開展進一步的工作。

一、試劑準備

1.LB液體培養基：胰化蛋白腖（細菌培養用）10g，酵母提取物（細菌培養用）5g，NaCl 10g，加ddH2O至1000ml，完全溶解，分裝小瓶，15lbf/in2高壓滅菌20min。

2.1.5%瓊脂LB固體培養基: 稱取1.5g瓊脂粉放入300ml錐形瓶,加100mlLB，15 lbf/in2 高壓滅菌20min，稍冷卻，製備平皿。

3.20% 麥芽糖：麥芽糖20g，加ddH2O 至100ml，0.22μm濾膜過濾。

4.SM液：NaCl 5.8g，MgSO4·7H2O 2g，1M Tris·CL（PH7.5）50ml，2%明膠 5ml，加ddH2O 至1000ml。15lbf/in2高壓滅菌20min。

5.RNase A 10mg/ml，TE配製，沸水浴15min，分裝後貯存於-20℃。

6.DNase I 10mg/ml，TE配製，分裝後貯存於-20℃。

7.PEG 80008，10%SDS9，EDTA: 0.5M pH8.03，苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），異丙醇，無水乙醇，70%乙醇

 

二、操作步驟

1.λ噬菌體平板培養

(1)用SM液10倍梯度稀釋λ噬菌體原種。

(2)取0.1ml各梯度稀釋離心到一消毒微量離心管中，加0.2ml新鮮培養的宿主菌，加麥芽糖(0.2%)，MgSO4(10mM)，37℃溫育20min，使噬菌體顆粒吸附於細菌。

(3)取熔化（47℃）0.7%瓊脂LB固體培養基3ml與上述管混勻，立即倒入預備（2-4天）的含凝固1.5%瓊脂LB固體培養基的平板內，輕輕晃動平板使均勻分布。

(4)37℃培養6-8hr後，觀察噬斑形成。

(5)用剪去部分頭部的吸頭挖取單個噬斑到0.5ml的SM液中，加0.05ml氯仿，震蕩。37℃溫育10min。

(6)重複⑴-⑷，獲得單個噬斑滴度。

2. λ噬菌體液體培養

(1)取2ml新鮮培養的宿主菌，離心，0.4ml LB培養基重懸，加λ噬菌體0.1ml（新鮮獲得的單個噬斑，依滴度使之與宿主菌比約1/500-1000）。

(2)加麥芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37℃溫育20min，使噬菌體顆粒吸附於細菌。

(3)加到100mlLB液體培養基中，加麥芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37℃搖震培養9-12hr後可見裂解發生。

(4)加0.1ml氯仿，37℃繼續搖震培養10-20min。

3. λ噬菌體DNA提取

(1)將上述裂解液轉移至離心管，離心8000g×10min，去細菌碎片，取上清液。

(2)加RNase A、DNaseI 至1μg/ml， 37℃溫育30min。

(3)加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，搖勻至溶解，冰浴1hr或4℃過夜。

(4)4℃離心10000g×20min，去上清液。

(5)加2ml SM液，充分洗溶管壁及沉澱，移到新微量離心管，加20μl 10%SDS，20μl 0.5M EDTA，68℃15min。

(6)加等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），混勻，離心12000g×5min，取上層液到一新微量離心管，加等體積氯仿/異戊醇（24：1），混勻，離心12000g×5min。

(7)取上層液到一新微量離心管，加等體積異丙醇，混勻，-20℃1hr，4℃離心12000g×10min，去上清液。

(8)1ml預冷的70%乙醇洗滌沉澱1-2次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉澱室溫下晾幹。

(9)沉澱溶於20μl TE，-20℃保存備用。

 

三、注意事項

1.用於裂解的噬菌體、宿主菌為新鮮培養獲得時，裂解好、裂解噬菌體收獲量大。

2.液體培養裂解時，如到培養時間時裂解尚未發生，可適當提高培養溫度或加大搖震速度。

3.RNase A 、DnaseI消化不全，DNA、RNA可粘走部分噬菌體。

4.苯酚/氯仿抽提時，注意PEG、蛋白質等雜質汙染，它們會影響限製性內切酶切割。