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通過平板裂解和刮取製備λ噬菌體原種



錄入時間:2011-9-23 16:29:27 來源:生物在線

方法:

1、鋪平板感染培養物的製備:

對直徑為10cm的培養皿,取105pfu的噬菌體(通常約為一個噬菌斑重懸液的1/10或一個大噬菌斑重懸液的1/100)與0.1ml鋪平板細菌混勻。

對直徑為15cm的培養皿,去2*105pfu的噬菌體與0.2ml鋪平板細菌混勻。

至少要置一個含為感染細胞的對照管,將感染培養物和對照均置於37℃培養20min,將病毒吸附到細胞上。

如果製備不易生長的λ噬菌體原種、則每0.1ml的鋪平板細菌就要接種106pfu的噬菌體。

2、3ml已熔化的47℃的瓊脂糖(10cm平板)或7ml(15cm平板)至感染細胞的第一個試管中,通過輕拍或渦旋振蕩數秒混勻,立即倒入已表明的瓊脂平板中央。盡量避免氣泡的產生。選擇平板確保細菌和頂層瓊脂糖分布均勻。重複這一步,知道每管中的東西均轉移至各個平板中。

3、將平板於37℃正置約12-16h。

在培養過程中平板沒有倒置,是為了防止頂層瓊脂糖滑脫和鼓勵在平皿表麵形成水珠,後者使得噬菌體更容易擴散。

在收集時,噬菌斑應相互接觸,細菌生長的惟一可見跡象是標誌著相鄰噬菌斑結合部位的輕薄透明的邊緣帶。含未感染細胞的屏蔽應形成一光滑的菌苔。

4、收集:

①    當發生融合裂解時,加5mlSM於平板中,然後用無菌的玻璃刮刀輕輕刮取頂層軟瓊脂糖至一無菌離心管中。

②    再加2ML SM於平板中,衝洗剩下的頂層瓊脂,與上述離心管的頂層瓊脂混合。

③    加0.1氯仿至瓊脂糖懸浮液中,37℃輕搖混勻15min。

④    將懸浮液4000g(5800r/min 於Sorvall  SS-34)4℃離心10min,回收上清,加1滴氯仿。保存病毒原種

 

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