細菌的人工培養方法

 

了解常用的液體、固體和半固體培養基的成分、製備方法和用途。初步掌握各種培養基接種技術；觀察細菌在培養基中的生長現象；認識菌落、菌苔。

 

培養基是用人工方法將微生物生長繁殖所需的多種營養物質調配在一起，形成的一種營養物質的混合物，用以分離、傳代和培養細菌。按培養基的用途分為基礎（普通）培養基、營養培養基、鑒別培養基，選擇培養基、厭氧培養基等。按培養基的物理形狀又分為液體、固體和半固體三種。

 

三角燒瓶、天平、試管、平皿、高壓消毒滅菌器。

 

培養基是人工配製的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養基質，用以培養、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產物。在自然界，微生物種類繁多，營養類型多樣，加之實驗和研究目的不同，所以培養基的種類很多。但是，不同種類的培養基中，一般應含有水分、碳源、氮源、無機鹽、生長因子等。

 

不同的微生物在固體、半固體和液體培養基中能表現出各自特有的培養特征，這些特征可以作為不同種類微生物的鑒別特征之一。了解它們的培養特征、掌握其生長規律對識別、控製和利用微生物具有重要價值。

 

（一）常用培養基的製備

1、普通液體培養基

(1)將新鮮的精牛肉除去脂肪和筋膜製成肉餡，取500克牛肉餡加l000ml蒸餾水，置4℃冰箱浸泡過夜，使牛肉中的水溶性營養物質充分浸出。

(2)次日將浸泡過夜的牛肉餡加熱煮沸30分鍾，放涼，使殘餘的脂肪凝固，然後用紗布和濾紙過濾，最後將濾液補足為原量，此種液體為牛肉浸汁。

(3)取1 000ml牛肉浸汁加蛋白腖10克，氯化鈉5克加熱溶解，冷至50℃左右時用氫氧化鈉調整pH至7．6，再煮沸10分鍾(因牛肉浸汁中部分碳水化合物，經加熱破壞產酸，影響pH；產生多磷酸鹽，培養基不澄清)待冷卻後，再調整pH至7．6，然後以濾紙過濾，濾液必須澄清，此種液體稱為肉湯培養基。

(4)將肉湯培養基分裝於試管或三角燒瓶中，塞好試管和瓶塞，包裝好後，用15磅(121℃)蒸氣15～30分鍾滅菌。待冷後，置4℃冰箱中保存備用。牛肉湯培養基主要用於純種細菌的培養和增菌，也是其它培養基的基礎。

 

2、普通瓊脂培養基

(1)取100ml牛肉湯加入2～3克瓊脂(根據瓊脂凝固程度決定)。

(2)加熱100℃溶化後，趁熱調整pH為7．4。

(3)分裝於試管或三角燒瓶中，塞好試管和瓶塞，包裝好後，用15磅滅菌15～30分鍾。

(4)待培養基冷至50℃左右無菌操作倒入無菌試管，趁熱將試管斜置，冷凝後即為瓊脂斜麵培養基；將培養基倒入無菌平皿，平放，待凝固後即為普通瓊脂平板。置4℃冰箱中保存備用。瓊脂斜麵培養基主要用於純種細菌的培養，瓊脂（瓊脂血）平板主要用於雜種細菌的分離和藥物敏感性試驗等。

 

3、半固體培養基

其製備方法基本上與普通瓊脂培養基相同，隻將瓊脂的用量改為0．3％～0.5％即可。通常分裝於試管內占試管體積的1/3的量，高壓滅菌後直立，使其凝固成高層。半固體培養基可供檢查細菌動力和保存菌種之用。

 

4、血液瓊脂培養基： 

(1)將製好的普通瓊脂培養基高壓滅菌後。

(2)待冷至56℃左右時，加入5％～10％脫纖維的無菌的綿羊的血液（也可用家兔血和人血），混勻(注意勿產生氣泡)，分別倒人滅菌試管或平皿中，即製成血瓊脂斜麵或血液瓊脂平板。置4℃冰箱備用，血液瓊脂平板是咽拭子最常用的培養基。

 

5、蛋白腖水培養基：

取100ml蒸餾水，加入蛋白腖1克和氯化鈉0．5克，加熱溶解，待冷卻後，調整pH為7．6，分裝於試管或三角燒瓶中，15磅滅菌15～30分鍾，待冷，置4℃冰箱中保存。蛋白腖水培養基常用於製備單糖發酵管或用於檢查細菌的吲哚試驗等。

 

（二）細菌培養基的接種方法

1、分離培養法(平板劃線法)

 

（1）分區劃線：

①右手持接種環在酒精燈火焰上燒灼滅菌，待冷（稍待約5～10秒鍾），取細菌培養物（或病人材料）少許。

②左手持瓊脂平板底部拇指稍頂開平皿蓋（接種環能進入方便操作即可），並靠近酒精燈火焰(火焰周圍直徑10cm左右範圍空氣中細菌含量少)附近操作，以免空氣中雜菌落入。右手握持沾菌的接種環在瓊脂平板邊緣上端來回劃線塗成菌膜，菌膜占總麵積的1/10，劃線時接種環的麵與平板麵成45度角輕輕接觸，以手腕的力在平皿表麵做輕輕的滑動，劃線要求密集平行，充分利用平板表麵。

③燒灼接種環，殺滅環上殘留的細菌，待接種環冷卻後將接種環通過菌膜處作連續劃線，以占平皿麵積的1/5，為一區劃線。

④左手旋轉平皿90度左右，燒灼接種環，殺滅環上殘留的細菌，待接種環冷卻後，繼續用接種環通過一區2～3次連續劃線占平皿麵積的另1/5，為第二區劃線。

⑤如此重複操作3～5次。

將培養皿放置37℃溫箱內，翻轉培養(即皿底在上，蓋在下)。經37℃，24小時培養後取出，觀察瓊脂平板表麵生長的各種菌落，注意其大小、形狀、邊緣、表麵、透明度、顏色等性狀。在血瓊脂平板上，尚可觀察菌落四周有無溶血現象。

 

(2)連續劃線法：

這種方法主要適應於熟練技術人員。以無菌操作取標本塗抹於平板邊緣的上端成菌膜，占平板麵積的1/10，酒精燈火焰上燒灼接種環法滅菌，待冷卻後重複塗抹菌膜一部分，再向下連續劃線至平板底部，經37℃培養18～24小時後觀察生長情況。

 

2、斜麵培養基接種方法

①左手的拇指、食指、中指、無名指分別持握菌種管與接種管，將兩管並列，略傾斜斜麵部均向上，右手分別轉動兩管棉塞，以便接種時易於拔取。

②右手執持接種環(姿勢與握鉛筆相似)，接種環和環柄的金屬部分酒精燈燒灼滅菌。

③以右手手掌與小指、小指與無名指分別拔取並夾持兩管棉塞，將兩管管口迅速通過酒精燈火焰滅菌。

④將滅菌並已冷卻的接種環伸入菌種管中，從斜麵上刮取菌苔少許，退出菌種管，再伸進待接種的培養基管，自斜麵底部輕輕向上劃一條直線，再次深入底部在瓊脂表麵輕輕的蛇形劃線。沾菌的接種環，進出試管時，均不應觸及試管內壁。

⑤接種完畢，接種環酒精等火焰滅菌，將兩管管口迅速通過酒精燈火焰2～3次滅菌，塞回棉塞，標記培養管。經37℃孵育18～24小時後觀察生長情況。

 

3、液體培養基接種法

①握持菌種管及待接種即肉湯管的方法同斜麵培養基接種法。

②接種環滅菌冷卻後，伸入菌種管刮取少量菌苔退出菌種管，再伸人肉湯管，在接近液麵的管壁上輕輕研磨，並蘸取少許肉湯調和，使菌混合於肉湯中。