微生物無菌技術之滅菌方法（1）

采用無菌技術所達到的程度，可以是不同的。一般分為滅菌、消毒和防腐3個不同層次。滅菌指徹底、永久地消滅物體內外一切微生物；消毒指消除物體表麵或內部的病原微生物；防腐則是抑製物體內外微生物的生長。在微生物學研究、微生物工業生產和大型手術中，為了獲得可靠的結果、保證生產的順利或避免感染，要求將器具進行滅菌，甚至連場地和環境也要進行嚴格的滅菌，而對於一般的食品，為了保證其營養成分不受或少受破壞，所以通常隻須采取消毒和防腐措施。當然，我們通常在得了炎症時服用抗生素或磺胺類藥物抑製體內的致病菌，也可以認為是無菌技術的應用。例如在培養某些需要生長較長時間的微生物或組織時，通常要加入抑製細菌生長的抗生素。

　　實現滅菌的方法很多，基本上可以分為物理學方法和化學方法兩大類。

　　物理學方法主要包括加熱、超低溫、過濾和電離輻射等。

 

加熱可以引起生命物質如蛋白質、核酸和脂類的破壞，從而導致其死亡。目前使用的有兩大類，即幹熱滅菌和濕熱滅菌。

　　幹熱滅菌最常見的例子是用火焰滅菌。這是最徹底的滅菌方法，但是並不是隨時隨處可以應用的。我們常常用這種方法來處理病死的家畜家禽。實驗室或發酵車間也經常用火焰滅菌。在要求滅菌後的器具幹燥的情況下，通常也采用幹熱滅菌。例如用電烤箱在160℃左右保持2小時，可以將玻璃或金屬器皿完全滅菌。

　　濕熱滅菌的方法更多。因為在有水或水蒸汽存在的條件下，細胞內部更易遭受傷害，所以可以在較低的溫度和較短的時間內達到滅菌的目的。微生物的營養細胞比較容易被殺死，而芽孢則較耐熱。下表列出了在濕熱條件下殺滅幾類主要微生物所需要的溫度和時間。

 

微生物	營養細胞	孢子或芽孢
酵母菌	50-60℃，5分鍾	70-80℃，5分鍾
黴菌	62℃，30分鍾	80℃，30分鍾
細菌（中溫細菌）	50-70℃，10分鍾	2-800分鍾，100℃；或120℃，05-12分
病毒	60℃，30分鍾

 

 

目前采用的濕熱滅菌方法有：

　　1）常壓法。其中主要有巴斯德消毒法、煮沸消毒法和間歇滅菌法。前兩種條件比較溫和，所以不能消滅全部微生物，因此是消毒。

　　巴斯德消毒法最早是法國偉大的微生物學家巴斯德用來處理葡萄酒防止其變酸的辦法，所以一直用巴斯德的名字命名。這種方法目前仍然大量使用在食品行業，用於牛奶、啤酒、果酒和醬油等的消毒。消毒後可以保持食品的原有風味。這種方法具體實施時對溫度和作用時間的控製要看處理對象決定。例如目前對牛奶的消毒就有低溫維持法和高溫瞬時法兩種，前者是在63℃維持30分鍾，後者則是在72℃處理15秒。

　　煮沸消毒法是在常壓下通過煮沸來達到消毒目的。例如在非高原地區將水加熱到100℃來消毒飲用水。

　　間歇滅菌法又叫分段滅菌法。在沒有高壓滅菌設備，滅菌對象又比較穩定的情況下，可以達到基本完全滅菌的目的。一般用於液體的滅菌。方法是將要滅菌的液體在90-100℃加熱15分鍾以上，使營養細胞死亡，然後將其冷卻到30℃，並保持這個溫度過夜，這時，滅菌樣品中沒有被殺死的芽孢因為溫度適合而萌發成營養細胞，到第二天再把該液體在90-100℃加熱15分鍾以上。如此重複3次，即可以將液體中的微生物全部殺死，達到滅菌的目的。某些做微生物學實驗的培養基，因為某些成分在120℃左右容易破壞，就可以采用間歇滅菌法。

　　2）加壓法。又稱加壓蒸汽滅菌法，因為在超過大氣壓的密閉容器中，水蒸汽的溫度可以大於100℃，更有利於殺死微生物。例如用加壓滅菌鍋（亦可用家用壓力鍋），當鍋內壓力達到每平方厘米1千克時，水蒸汽的溫度可以達到121℃，一般微生物的營養細胞和芽孢在這個溫度下通常在15-30分鍾內即可徹底被殺死。加壓蒸汽滅菌法是微生物學研究和微生物應用產業中采用得最多的滅菌方法，從19世紀沿用至今。隨著滅菌器具的不斷改進，效率也越來越高。

 

 

冷凍和加熱的不同之處是這種方法不是簡單地破壞微生物，而是抑製微生物的生長和繁殖。低溫法抑菌在食品工業中采用最多，因為在低溫下（4℃左右）大多數病原菌都不能生長，在微生物學實驗和微生物工業中，這種方法不能起到滅菌的作用。一般在-20℃微生物就不會生長了，因為此時沒有液態的水供微生物活動之用，也有些微生物可以被冰殺死，因為冰會破壞微生物細胞膜

 

有些需要滅菌的材料不能受熱，例如許多維生素溶液。因此，許多液體可以用過濾法來滅菌。過濾法不是將微生物殺死，而是把它們排除出去。目前過濾除菌采用兩類器具，一類叫深層濾器，例如用燒結玻璃、不上釉的陶瓷顆粒或石棉壓成的濾板等：另一類是濾膜。深層濾器已經使用了100年以上，現在有逐漸被濾膜取代的趨勢，但因為大量沉澱物容易堵塞濾膜，所以一般先用深層濾器除去大的顆粒。

　　濾膜一般由醋酸纖維素、硝酸纖維素、多聚碳酸酯、聚偏氟乙烯等合成纖維材料製成。濾膜的孔徑一般為0.2微米，它可以濾除絕大多數微生物的營養細胞。過濾法的最大缺點是不能濾除病毒。

　　我們來看一下濾膜滅菌是如何工作的。如左圖所示，在一個漏鬥形容器上部放置數片濾膜。右圖是整個過濾係統。待除菌的液體裝在三角瓶中（1），用蠕動泵（2）將液體抽到過濾器（3）內，濾過的液體進入事先滅菌的瓶子中。

如果是滅菌少量液體，可以采用一種簡單的的濾器。

　　過濾法用途廣泛，除在飲料、藥物生產中使用外，空氣也常常用過濾法除菌。我們通常做微生物學實驗時滅過菌的容器一般用棉花塞堵在出口處，實際上就是過濾除去空氣中的微生物，使進入容器的空氣中沒有微生物汙染。微生物學實驗室使用的超淨台也是用過濾法除菌。

 

輻射滅菌是利用電磁輻射產生的電磁波殺死大多數物質上的微生物的一種有效方法。用於滅菌的電磁波有微波、紫外線（UV）、X射線和γ射線等。它們都能通過特定的方式控製微生物生長或殺死微生物。例如微波可以通過熱產生殺死微生物的作用；紫外線使DNA分子中相鄰的嘧啶形成嘧啶二聚體，抑製DNA複製與轉錄等功能，殺死微生物；X射線和γ射線能使其它物質氧化或產生自由基（OH·H）再作用於生物分子，或者直接作用於生物分子，打斷氫鍵、使雙鍵氧化、破壞環狀結構或使某些分子聚合等方式，破壞和改變生物大分子的結構，從而抑製或殺死微生物。即使可見光在長時間照射後，也能損害微生物或殺死它們，因為所有光合生物含有葉綠素（或細菌葉綠素）、細胞色素、黃素蛋白等光敏感色素，它吸收光能變成激發態或被活化，並將吸收的能量轉移到氧，產生氧自由基作用於細胞，導致機體突變或死亡。輻射滅菌的效果受其它因子製約，例如光可使嘧啶二聚體解體，降低紫外線作用效果，氧可提高X射線或γ射線作用效果等。

　　實行輻射滅菌的裝置包括微波爐、紫外光燈、陰極射線管、X射線發生器、放射性核素等。商業上用於大量物品滅菌使用的放射性源是鈷-60和銫-137，它們發射出γ射線，相對而言比較廉價。輻射滅菌用途很廣，例如醫療器械和用具（如注射器燈）、食品、實驗室的許多塑料製品和多種培養基都是用這種方法滅菌。