臨床微生物實驗室細菌鑒定指南（上）

一．細菌的鑒定步驟

1． 鑒定的概念：將一個未知的菌株按其生物學特性，經過與所有已知菌種進行比較後劃歸到一個已知菌種的分析過程。

2． 對待鑒定的菌種要明確已經獲得純化培養或者該菌種在血平板上生長良好，有單個菌落可以進行生化試驗。（我們這裏一般都是預先純化培養）

3． 對待鑒定的菌種進行革蘭染色，觀察形態（G⁺c，G^–b，G^–c，G⁺b），做觸酶，氧化酶實驗，然後按科，屬，種逐步鑒定。要注意對待鑒定的菌種選擇一個合適的鑒定係統，臨床常見細菌的快速簡單的鑒定係統我們都已經設計好，參考鑒定質控單。

4． 按鑒定質控單的要求填寫好病人姓名，年齡，性別；標本類型，標本編號，送檢日期等。另外最重要的是要填寫好該菌種的菌落形態以及有無溶血。

5． 複習革蘭染色，觸酶實驗，氧化酶實驗。

⑴．革蘭染色：是細菌鑒定過程中最常用最基本最重要的染色方法。

首先要將待鑒定的細菌塗片，固定（目的：殺死細菌，改變細菌對染料的通透性）。

第一步：以結晶紫初染（染色液Ⅰ）

第二步：以盧戈氏碘液媒染（染色液Ⅱ）

第三步：用95%乙醇脫色（染色液Ⅲ）

第四步：最後用稀釋複紅複染（染色液Ⅳ）

⑵．觸酶實驗(H₂O₂實驗)：

a.原理：具有過氧化氫酶的細菌能催化雙氧水生成水和初生態氧，繼而形成氧分子出現氣泡。

b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在潔淨的玻片上塗開，滴加3%過氧化氫數滴，觀察結果（立即有大量氣泡產生者為陽性，不產生氣泡者為陰性）。要注意不能在血平板上進行實驗，這樣易出現假陽性；另外陳舊菌落要是進行實驗可能會導致假陰性結果；還有不能在接種針或環上進行實驗。

c.陽性對照用金黃色葡萄球菌，陰性對照用鏈球菌；試劑要避光置4℃冰箱保存。

d.應用：絕大多數含細胞色素的需氧和兼性厭氧細菌觸酶實驗陽性，鏈球菌屬陰性。臨床常見細菌鑒定實驗中我們一般用於區別葡萄球菌屬（+），微球菌屬（+），鏈球菌屬（－）。

⑶．氧化酶實驗（Kovac實驗）：

a.       原理：氧化酶又稱細胞色素酶，是細胞色素呼吸酶係統的最終呼吸酶。酶並不直接與試劑（1%鹽酸四甲基對苯二胺）起反應，而是首先使細胞色素c氧化，然後氧化型細胞色素c使對苯二胺氧化，出現深蘭色反應。

b.       方法（濾紙法，菌落法，試劑紙片法）：

一般我們采用濾紙法，取白色潔淨濾紙條，沾取菌落少許，加試劑一滴，陽性者立即呈粉紅色，繼而出現深蘭色。結果讀取在10秒鍾時為最佳，60秒內讀取可靠。本實驗避免接觸含鐵物質（假陽性），也不能在含糖培養基上生長的菌落進行實驗（假陰性）。

c.       陽性對照用銅綠假單胞菌，陰性對照用大腸埃希菌。

d.       應用：奈瑟氏屬的菌種均陽性，也用於區別假單胞菌屬和腸杆菌，前者陽性，後者陰性。

 二．葡萄球菌屬的鑒定

  葡萄球菌屬主要的種有金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌。

1． 形態與染色：葡萄球菌直徑0.5～1.5μm，菌體圓形，呈單個，成雙以及不規簇狀排列。染色呈紫色，為革蘭陽性球菌。

2． 與鏈球菌的區別：觸酶實驗為陽性，而鏈球菌陰性；菌體形態鏈球菌小於葡萄球菌，呈成雙和鏈狀排列的卵圓形的革蘭陽性球菌。

3． 與微球菌的區別：觸酶實驗同為陽性，但微球菌的菌體呈四聯狀，要大於葡萄球菌，微球菌葡萄糖氧化發酵實驗（操作方法同甘露醇OF試驗）為氧化型；而葡萄球菌為發酵型。另外呋喃唑酮（即痢特靈50μg/片）敏感實驗微球菌為耐藥，而金黃色葡萄球菌為敏感。

4． 葡萄球菌屬的種間鑒定：

⑴．菌落色素與溶血毒素：金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃色，檸檬色或者淡黃色，而其他葡萄球菌則在血平板上菌落大多數為白色，也有部分為檸檬色或深黃色。

⑵．溶血毒素：金黃色葡萄球菌有α﹑β﹑γ﹑δ溶血毒素，各毒素的區別是對動物紅細胞的溶血範圍﹑抗原性及溶血時的溫度等。其中以α溶血毒素為主。而其他葡萄球菌大多數不產生溶血毒素，隻有表葡有極少能產生溶血毒素。

⑶．血漿凝固酶實驗：用與區別金黃色葡萄球菌（陽性），表皮葡萄球菌（陰性），腐生葡萄球菌（陰性）。血漿凝固酶是金葡菌所產生的，有結合凝固酶和遊離凝固酶兩種。血漿凝固酶檢測有兩種方法，為玻片法和試管法，我們一般采用玻片法。

a. 操作方法：挑取少許金黃色葡萄球菌菌落在玻片上與血漿乳化，結合凝固酶能作用於血漿中的纖維蛋白原，從而在金黃色葡萄球菌表麵發生凝集，所以我們肉眼能看見凝集顆粒。玻片法主要由結合凝固酶作用產生；遊離凝固酶是金黃色葡萄球菌產生的胞外酶，能與血漿中的血漿凝固反應因子（類似凝血酶的一種物質）作用，形成複合物再使纖維蛋白原轉化成纖維蛋白而發生凝集。試管法主要由遊離凝固酶作用產生。

b. 注意事項：菌落不能太多，否則會影響結果觀察；凝固酶陽性要做自凝陰性對照（用生理鹽水代替血漿），隻有在陰性對照也不凝集才能認為是真正的陽性，有一部分葡萄球菌有自凝現象。

⑷．新生黴素敏感實驗：金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌對新生黴素紙片（5μg/片）敏感；而腐生葡萄球菌，微球菌則對之耐藥。抑菌環直徑>16mm即為新生黴素敏感。

⑸．甘露醇氧化發酵實驗：

a.操作方法：取兩支甘露醇微量生化管，在微量管內接種待檢細菌，然後一支加兩滴石臘密封，另外一支則不加，放37℃孵箱內18～24h後觀察結果。

b.結果觀察：微量生化管變黃色為陽性，也就是能利用甘露醇。若兩管都變黃色則說明是發酵型；其中加石蠟管不變色，沒加石蠟管變黃色則為氧化型；如果兩管都不變色則說明該細菌是不利用甘露醇（產堿型）。

c.應用：金黃色葡萄球菌在需氧和厭氧的條件下都能利用甘露醇（即兩管都變黃色）；表皮葡萄球菌需氧部分產酸，厭氧條件下不利用甘露醇（即沒加石蠟管有部分會變黃色，加石蠟管不變黃色）；腐生葡萄球菌與表皮葡萄球菌類似。

 三．微球菌屬的種間鑒定

微球菌屬主要的種有易變微球菌，藤黃微球菌，玫瑰微球菌。鑒定生化見下表

       d：不定     S：敏感     R：耐藥

 四．鏈球菌屬

1． 形態和染色：鏈球菌的直徑為0.5～1.0μm，呈成雙和鏈狀排列的卵圓形革蘭陽性球菌，菌體小於葡萄球菌，無鞭毛，沒有芽胞，但有些菌株會形成莢膜。肺炎鏈球菌呈矛頭狀，寬端相對，尖端向外。

2． 根據鏈球菌在血平板上溶血現象的不同分為三種：⑴甲型（α-）溶血，即菌落周圍出現較窄的草綠色溶血環；⑵乙型（β-）溶血，即菌落周圍出現較寬的透明溶血環；⑶丙型（γ-）溶血，即菌落周圍無溶血環。

3． 根據抗原結構（C多糖抗原）的不同可分為A﹑B﹑C﹑D﹑E﹑F﹑G﹑H﹑K﹑L﹑M﹑N﹑O﹑P﹑Q﹑R﹑S﹑T等18個群，對人類有致病者90%屬於A群，偶見其他群鏈球菌致病。

4． 鏈球菌屬的種間鑒定

⑴．乙型溶血鏈球菌的鑒定：

a． 對杆菌肽（0.04U/片）（抑菌圈直徑≥10mm）敏感：A群鏈球菌（主要為化膿性鏈球菌）。

b． 對杆菌肽不敏感，膽汁七葉苷實驗陰性，但馬尿酸鈉水解實驗﹑CAMP實驗陽性：B群鏈球菌（主要為無乳鏈球菌）。

c． 對杆菌肽不敏感，膽汁七葉苷實驗陰性，馬尿酸鈉水解實驗陰性，CAMP實驗陰性：主要為馬鏈球菌﹑類馬鏈球菌﹑獸疫鏈球菌；對三者的區別實驗要加做海藻糖和山梨醇實驗。

d． CAMP實驗：將能產生β-溶血的金黃色葡萄球菌在血平板上劃一橫線接種，再將待鑒定菌於金黃色葡萄球菌3mm處垂直種一短線，若在有CO₂條件下培養5～6小時，或無CO₂條件下培養18～24小時，在兩細菌連接處出現一個半月型的加強溶血區即為CAMP實驗陽性。

⑵．甲型溶血鏈球菌的鑒定：

a． 草綠色鏈球菌：對杆菌肽敏感，對奧普托欣（Optochin）不敏感，膽汁溶菌實驗陰性，膽汁七葉苷實驗陰性，在高鹽中不生長。主要有變異鏈球菌，輕型鏈球菌，血鏈球菌，唾液鏈球菌等。

b． 肺炎鏈球菌：菌體呈矛頭狀，成雙排列，鈍端相對，尖端相背，較葡萄球菌，其他鏈球菌略大；在血平板上菌落細小﹑圓形﹑表麵光滑﹑灰白色﹑半透明，開始時菌落呈扁平狀，以後中心塌陷，呈臍窩狀。與草綠色鏈球菌的主要區別是膽汁溶菌實驗陽性，對奧普托欣（Optochin）敏感。奧普托欣（Optochin）含量為5μg/片，抑菌環>18mm為敏感，<15mm為不敏感，15～18mm應重複實驗。

⑶．腸球菌（D群鏈球菌）的鑒定：

溶血不定，主要是α-﹑γ-溶血；對杆菌肽不敏感，但其特異性實驗是膽汁七葉苷實驗陽性；若能在6.5%NaCl的心浸液肉湯中生長即為D群腸球菌，不能生長為D群非腸球菌。

⑷．鏈球菌屬鑒定的係統生化結果判斷

a． 1%美蘭牛乳

b． 膽汁七葉苷實驗：變黑為陽性。

c． PH9.6肉湯實驗：變渾濁為能在堿性環境中生長（陽性）。

d． 6.5%NaCl心浸液肉湯：由紫變黃為能在高鹽環境中生長（陽性）。

e． 精氨酸雙水解酶實驗：變紅色（對照不變色，仍為黃色）為陽性。

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