臨床微生物實驗室細菌鑒定指南（下）

五．奈瑟氏菌屬和布蘭漢菌屬

奈瑟氏菌屬主要有腦膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌；布蘭漢氏菌屬隻有卡他布蘭漢氏菌。兩者係需氧革蘭陰性球菌。

⑴     奈瑟氏菌的生物學特性：革蘭陰性球菌，需氧，卵圓形或腎形，無動力，氧化酶及觸酶均陽性。培養時對營養要求高，能在巧克力平板或有豐富營養的血平板上，在5～10%CO₂環境中生長。

⑵．鑒定過程：

a． DNA酶實驗陽性為布蘭漢氏菌，陰性則為奈瑟氏菌。

b． 能在普通血平板上生長的為其他奈瑟氏菌，在巧克力平板上生長的主要為腦膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌。

c． 能使麥芽糖氧化分解產酸的是腦膜炎奈瑟氏菌，不利用麥芽糖的是淋病奈瑟氏菌。

      ⑶．幾種主要細菌對葡萄糖﹑麥芽糖﹑蔗糖的氧化分解產酸結果如下：

                                氧化分解產酸

⑷     DNA酶實驗：

a． 方法：將待鑒定細菌點種於含0.2%DNA的DNA瓊脂平板上，培養後用1mmol/LHCl覆蓋平板，菌落周圍出現透明環者為陽性。

b． 原理：某些細菌能產生DNA酶，可使DNA長鏈水解成由幾個單核苷酸組成的寡核苷酸鏈；長鏈DNA可被酸沉澱，而水解後形成後的寡核苷酸鏈則可溶於酸，故在DNA瓊脂平板加鹽酸，可在菌落周圍形成透明的溶血環。（腸杆菌科中隻有沙雷氏菌和變形杆菌可產生DNA酶，陽性球菌中隻有金葡菌能產生DNA酶。）

   六．腸杆菌科

腸杆菌科是一大群生物學性狀相似的革蘭陰性杆菌，其中對人致病性較強的鼠疫耶爾森菌（現已基本沒有流行）和傷寒沙門菌；4類常引起腹瀉和腸道感染的細菌（埃希氏菌﹑誌賀氏菌﹑沙門氏菌﹑耶爾森氏菌）和8種常導致院內感染的細菌（枸櫞酸杆菌屬﹑克雷伯菌屬﹑腸杆菌屬﹑多源菌屬﹑沙雷菌屬﹑變形杆菌屬﹑普羅威登菌屬和摩根菌屬）。另外還有很多細菌是腸道的正常菌群，但在一定條件下也可致病（條件致病菌）。

實驗過程中對於革蘭陰性杆菌首先要做氧化酶實驗，陰性為腸杆菌科細菌；陽性的為非發酵菌（我們實驗室還沒有簡單的係統鑒定方法，一般要儀器上卡檢測）或弧菌科細菌。

1． 腸杆菌科的係統生化

⑴．KIA試驗（克氏雙糖鐵）

組成：乳糖／葡萄糖=10／1（斜麵／高層，其長度最好是都是2CM）

結果判斷：斜麵或高層變黃色：陽性；不變色（紅色）：陰性

          高層中出現裂隙：產氣陽性

          高層中出現黑色（FeS）：產H₂S陽性

⑵．苯丙氨酸脫羧酶試驗

細菌產生的苯丙氨酸脫羧酶使苯丙氨酸氧化脫羧後生成苯丙酮酸，再與10%的FeCl₃試劑產成深綠色反應。（變形杆菌屬﹑普羅威登菌屬和摩根菌屬為陽性，其他為陰性）

⑶．枸櫞酸鹽試驗（碳源利用實驗）

在枸櫞酸鹽培養基中細菌能利用的碳源隻有枸櫞酸鹽，分解後生成碳酸鈉，使培養基變堿性，pH指示劑溴麝香草酚藍由淡綠色變為深蘭色，即為枸櫞酸鹽試驗陽性。（埃希氏菌屬，誌賀氏菌屬，愛德華菌屬為陰性，其他為陽性）

注意：接種時不能被糖，蛋白腖汙染，要單獨接種）

⑷．甲基紅（MR）試驗

細菌分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸進一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸等，使培養基的pH下降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑由桔黃色變桔紅色為弱陽性；變紅色為陽性。

培養基成分：葡萄糖蛋白腖水

試劑：甲基紅0.1g，酒精300ml，水200ml

主要用於大腸埃希菌（＋）和產氣腸杆菌（－）的鑒別；常與V-P實驗聯合使用，一般情況下兩者結果正好相反，但也有例外如奇變兩者同為陽性。

⑸．MIU（動力－靛基質－尿素）試驗

①．動力：在半固體培養基中穿刺接種細菌培養後，若穿刺線周圍有細菌擴散生長，則為動力（＋）；清晰則為動力（－）。

②．靛基質試驗（吲哚試驗）：某些細菌有色氨酸酶，能分解培養基中的色氨酸生成吲哚。吲哚再與試劑對位二氨基苯甲醛作用形成玫瑰吲哚而呈紅色。

③．尿素試驗：某些細菌能產生尿素酶，分解尿素產生大量的氨，使培養基變堿，再使培養基中的指示劑（0.4%酚紅）變紅色即為陽性。

         ⑹．硝酸鹽還原試驗

NO₃ˉ→→NO₂ˉ（大腸）

NO₃ˉ→→NH₄^＋

NO₃ˉ→→N₂（沙雷氏菌屬）

試劑甲：對氨基苯磺酸

試劑乙：α-萘胺

觀察結果時甲液和乙液要等量加入，立即或10min內出現紅色為陽性。若不變色，則要加入鋅粉：①變紅色，說明硝還試驗為真陰性②仍不變色，說明硝還試驗真陽性，但原先還原產物不是NO₂ˉ。

陰性結果出現時有三種可能：①細菌不能還原硝酸鹽②亞硝酸鹽繼續分解生成氨或氮③培養基不適合細菌生長

腸杆菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。

         ⑺．氨基酸脫羧試驗

            細菌產生脫羧酶分解氨基酸使其脫羧生成胺和CO₂，雖然各種細菌所產生的脫羧酶不一定相同，但最後都能生成胺（賴氨酸→屍胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和CO₂。然後胺能使培養基變堿性，通過指示劑（溴甲酚紫）由黃變紫即為陽性。對照管（無氨基酸）為黃色。

            注意：①微量管接種好後要加石蠟，使培養基造成厭氧環境。（生成的胺更穩定，還能誘導氨基酸脫羧酶的產生）

                 ②對照管如果不顯黃色，則結果不能判斷。

           應用：除傷寒沙門氏菌，雞沙門氏菌外，其他沙門氏菌鳥AA，賴AA均為陽性；除宋氏和鮑氏誌賀菌外其他誌賀菌也菌為陽性。

          ⑻．葡萄糖酸鹽試驗

             微量管在培養18～24h後，加班氏試劑，水浴煮沸10min，由蘭色變黃綠色到磚紅色即為陽性，不變為陰性。

1． 腸杆菌的鑒定流程

⑴．根據苯丙氨酸脫羧酶實驗：

   （＋）：變形杆菌屬，普羅威登斯菌屬，摩根氏菌屬

   （－）：埃希氏菌屬，誌賀氏菌屬，沙門氏菌屬，枸櫞酸杆菌屬，愛德華菌屬；克雷伯菌屬，腸杆菌屬，沙雷氏菌屬，哈夫尼亞菌屬。

⑵．苯丙氨酸脫羧酶實驗陰性，加做葡萄糖酸鹽實驗

（＋）：克雷伯菌屬，腸杆菌屬，沙雷氏菌屬，哈夫尼亞菌屬

a． 動力（－）：克雷伯菌屬，屬內種的鑒定主要根據吲哚試驗（肺克吲哚實驗陰性，三個亞種鑒別試驗IMViC：肺炎－－＋＋，臭鼻－＋－d，鼻硬結－＋－－）

b． 動力（＋），DNA酶（＋）：沙雷氏菌屬

動力（＋），DNA酶（－），枸櫞酸鹽（＋）：腸杆菌屬（主要是陰溝腸杆菌和產氣腸杆菌，前者賴氨酸陰性，而後中為陽性）

動力（＋），DNA酶（－），枸櫞酸鹽（－）：哈夫尼亞菌屬

（－）：加做IMViC（靛基質-甲基紅-VP-枸櫞酸鹽）試驗

a． IMViC（＋＋－－）：大腸埃希菌（H₂S－）或愛德華菌屬（H₂S＋）。

b． IMViC（^－／_＋＋－＋）：枸櫞酸杆菌屬

⑶．苯丙氨酸脫羧酶實驗陽性，根據產H₂S可分

（＋）：變形杆菌屬

                 屬內主要鑒定試驗如下

（－）：普羅威登氏菌屬，摩根氏菌屬

       普羅威登氏菌屬：鳥氨酸：－；枸櫞酸鹽：＋（屬內鑒定尿素酶及一些碳水化合物的產酸試驗，如甘露醇﹑阿拉伯糖﹑海藻糖等）

       摩根氏菌屬：鳥氨酸：＋；枸櫞酸鹽：－（隻有一個種：摩氏摩根氏菌）

⑷．誌賀氏菌屬和沙門氏菌屬

這兩種菌屬在腸道選擇性培養基（SS、麥康凱）形成不發酵乳糖的透明或半透明的無色菌落，但一些沙門氏能產H₂S就會形成中心黑色的菌落，鑒定時在選擇性培養基上挑選可疑菌落進行鑒定。

a．誌賀氏菌屬

   主要係統生化：KIA：K/A（隻有福氏6型能產氣），H₂S（－）；MIU：－+/-－；

   苯丙：－；枸櫞酸鹽：－。

   報告結果時要根據其血清學的結果鑒定到種，即A群（痢疾誌賀氏菌）﹑B群（福氏誌賀氏菌）﹑C群（鮑氏誌賀氏菌）﹑D群（宋氏誌賀氏菌）；我國主要以B群和D群為主。

b．沙門氏菌屬

   主要係統生化：KIA：K/AG，H₂S（+/－）；MIU：＋－－；苯丙：－；枸櫞酸鹽：－。

  傷寒沙門氏菌的抗原結構：菌體抗原（O抗原），鞭毛抗原（H抗原），包膜抗原（主要是Vi抗原）

 根據係統生化鑒定到沙門氏菌屬後，在根據其抗原結構的特點，用血清學凝集分到種即可報告結果。

血清凝集步驟如下：

A-F多價O（＋）：

 O₂，Ha（＋）：A群（甲型副傷寒沙門氏菌）

 O₄，Hb（＋）：B群（乙型副傷寒沙門氏菌）

 O_6﹑7，Hc，Vi（＋）：C群（丙型副傷寒沙門氏菌）

 O₉，Hd，Vi（＋）：D群（傷寒沙門氏菌）

 O_3﹑10，Heh（＋）：E群

 O₁₁，Hi（＋）：F群

A-F多價O（－），做Vi血清因子凝集：（＋）濃菌液沸水煮沸30min，再用A-F多價O血清定群；（－）繼續以A-F以外的多價O血清凝集分型。

血清凝集注意：確定O群後， 一定要用H因子再做凝集；最終結果要以凝到H相後才能報告。

  七．非發酵革蘭陰性杆菌

非發酵革蘭陰性杆菌是指一群不利用葡萄糖或僅以氧化形式利用葡萄糖﹑需氧或兼性厭氧﹑無芽胞的革蘭陰性杆菌。氧化酶試驗一般陽性，除不動杆菌屬和嗜麥芽假單胞菌外。

非發酵菌按下列試驗進行初步分屬

下麵主要講一下銅綠假單胞菌：在血平板上形成的菌落大而扁平﹑濕潤﹑有金屬光澤，有生薑味的灰綠色或蘭綠色的菌落，並有明顯的溶血環。常有色素產生（綠膿素，青膿素，紅膿素，黑膿素等），在MH平板上更加明顯。

銅綠假單胞菌的最低鑒定標準：①動力＋②氧化酶＋③枸櫞酸鹽＋④氧化分解GLU，木糖⑤不利用麥芽糖⑥賴﹑鳥氨酸脫羧酶試驗－⑦精氨酸雙水解酶試驗＋⑧H₂S－。

八．棒狀杆菌屬

          棒狀杆菌屬是一群革蘭陽性杆菌。菌體大小長短不一，常一端或兩端膨大呈棍棒狀。

          大多數存在於水和土壤中，其中有的是人和動物粘膜上的正常菌群，若是從無菌部位分離到棒狀杆菌，應予以鑒定（如宮頸拭子）。

          在血平板上能生長，但生長不良好，菌落細小，濕潤。

      鑒定：根據觸酶和有無溶血，可分：

           ⑴．H₂O₂＋，無溶血：白喉﹑假白喉﹑潰瘍﹑幹燥﹑假結核﹑馬棒﹑牛棒

           ⑵．H₂O₂－，有溶血：溶血棒﹑化膿棒﹑陰道棒

           ⑶．加做葡萄糖，麥芽糖，蔗糖產酸試驗，結合⑴⑵和標本類型，基本上可以鑒定到是哪一種棒狀杆菌。

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