【關鍵詞】 中草藥植物； 內生放線菌； 抑菌活性
ABSTRACT This paper reports that total 84 or 36 out of the tested 560 endophytic actinomycetes strains from 68 Chinese medicinal herbs, showed inhibition activity against Staphylococcus aureus or Candida albicans, respectively, suggesting a potential source for novel antibiotics. Further investigation by using water or ethanol extracts of the nine herbs against Staphylococcus aureus, indicated no apparent relationships on inhibition of the pathogen between herbs and their endophytic actinomycetes.
KEY WORDS Chinese medicinal herbs; Endophytic actinomycetes; Inhibition activity
目前發現的放線菌(主要來自土壤)產生的抗生素和生理活性物質超過10000種，占已發現微生物藥物的約2/3［1］。近年來從獨特生境中分離放線菌並尋找新的抗生素已逐漸受到重視，如從植物組織內部中分離其內生放線菌和尋找新抗生素［2］。我國擁有豐富的中草藥植物資源，其中一些中草藥長期被用來清熱解毒、化膿消腫，提示可能存在抗菌活性物質。本文報道從68種中草藥植物中分離大量的內生放線菌，其中約15%菌株具有抗金葡菌的活性，約6%菌株對白念珠菌有抑菌活性。此外，初步探討了內生放線菌與其寄主植物在抗菌活性方麵可能的對應關係。
1 材料與方法
1.1 中草藥植物和病原菌來源
本試驗所用大部分中草藥植物采自上海植物園，丹參和燈盞花采自雲南昆明(邱明華研究員提供)，青蒿采自四川酉陽(利民青蒿基地提供)，金葡菌由揚州大學微生物實驗室金文傑老師提供。
1.2 培養基、試劑和抗生素
試驗中分離內生放線菌所用的為S培養基［2］、S培養基+重鉻酸鉀+萘啶酮酸、S培養基+重鉻酸鉀+萘啶酮酸+鏈黴素、S培養基+重鉻酸鉀+萘啶酮酸+萬古黴素等4種培養基(重鉻酸鉀的終濃度為85μmol/L，萘啶酮酸65μmol/L，鏈黴素2μg/ml，萬古黴素4μg/ml)，純化和進一步培養內生放線菌采用高氏一號培養基［3］。培養金葡菌用LB培養基。
1.3 植物內生放線菌的分離
將采摘的新鮮植物用清水洗淨，根、莖、葉各部分分開，於陰涼處風幹。用70%的乙醇、0.87%的次氯酸鈉和10%的碳酸氫鈉分別處理5、20和10min以達到表麵消毒，接著用無菌水洗滌三次，再用無菌濾紙吸幹水分。將植物剪成約
1.4 內生放線菌的抑菌試驗
金葡菌或白念珠菌接種於25ml LB液體，
1.5 植物的水或乙醇的提取及提取液的抑菌試驗
將采摘的新鮮植物用清水洗淨和風幹，一份稱取
2 結果
2.1中草藥植物的內生放線菌對金葡菌和白念珠菌的抑菌活性
從上海市植物園、雲南昆明和四川酉陽等地采集到68種中草藥植物，表麵消毒後在4種固體培養基上共分離，並初步鑒定了560株內生放線菌。這些放線菌菌株在高氏一號培養基上經劃線純化培養後打下圓形菌塊，置於混合有金葡菌或白念珠菌的平板上以檢測可能的抑菌活性。表1結果顯示，來自35種中草藥植物的84株內生放線菌對金葡菌具有抑菌活性(抑菌圈直徑在4.5～
除去分離到較少(如<5株)內生放線菌菌株的植物外，分離菌株較多的植物如紫金牛、野蕎麥、毛茛和紫菀等的內生放線菌菌株具有抑菌活性的比例較高，分別為56%、50%、50%和41%，提示具有抑製金葡菌活性的植物內生放線菌的分布可能有偏好性。
表1結果顯示，來自22種中草藥植物中的36株放線菌對於白念珠菌具有抑菌活性(約占測試菌株總數的6%)，其中來自貫眾、磨芋、敗醬和陸英等的內生放線菌菌株具有抑菌活性的比例較高， 分別為21%、表1 43種中草藥植物中對金葡菌和白念珠菌有抑菌活性的內生放線菌株數 20%、17%和29%。
2.2 中草藥植物的抽提液對金葡菌的抑菌活性
為了進一步研究內生放線菌菌株與其寄主中草藥植物在有或無抑菌活性方麵是否有對應關係，我們測定了一些植物提取液的抑菌活性。選取內生放線菌菌株具有較高抑菌比例的紫金牛、野蕎麥、毛茛、紫菀和貫眾等5種植物，以及具有較低抑菌比例的陸英、打破碗花花、括樓和澤蘭等4種植物，用水或70%乙醇抽提，檢測對金葡菌的抑菌活性。表2結果表明，雖然紫金牛、毛茛、紫菀和貫眾等4種植物的水或醇提取物具有抑菌活性，但野蕎麥的水或醇提取液中沒有檢測到抑菌活性；另一方麵，雖然括樓的提取液中沒有抑菌活性，但是陸英、打破碗花花和澤蘭的提取液中卻具有抑菌活性。這些結果顯示，內生放線菌菌株對金葡菌的抑菌活性與其寄主植物沒有明顯的對應關係。
3 討論
由於植物內生菌來自獨特的生存環境而成為人們尋找微生物新藥的一個重要藥源。在植物內生放線菌產生抗生素方麵，有報道從杜鵑花［6］、蛇藤［7］和衛矛科植物［8］分離到的內生放線菌產生了新的抗細菌或真菌的化合物。國內文獻報道了水稻內生放線菌產生抗真菌的活性［9］，三葉草中的內生放線菌有抗細菌活性［10］，西雙版納藥用植物中分離的165株內生放線菌中有70株表現抗多種細菌和真菌活性［11］。在我們的試驗中，發現68種中草藥植物的560株內生放線菌中表2 9種新鮮中草藥植物的抽提液對金葡菌的抑菌活性有84株(約15%)對金葡菌具有抑製活性，有36株放線菌(約6%)對白念珠菌具有抑菌活性，進一步表明中草藥植物內生放線菌可能是篩選抗菌新藥的一個重要資源。
1993年Stierle等［12］從短葉紅豆杉中發現一種可以產紫杉醇的內生真菌，此後還有許多類似的報道，導致了一種觀點：由於植物內生菌與寄主植物的協同進化，內生菌可以產生與寄主植物相同的物質。我們的試驗結果表明，至少對抑製金葡菌的活性而言，內生放線菌菌株的抑菌活性與其寄主植物的沒有明顯的對應關係。一種可能的原因是放線菌屬於原核生物，寄主植物為真核生物，兩者之間遺傳物質的交換特別是基因表達存在很大障礙；而同屬於真核生物的內生真菌與寄主植物的遺傳物質交流和表達的障礙較小。
【參考文獻】
［1］ Bérdy J. Bioactive microbial metabolites, a personal view ［J］. J Antibiot,2005,58(1):1～26.
［2］ 曹理想，周世寧. 植物內生放線菌研究［J］. 微生物學通報，2004，31(4)：93～96.
［3］ 阮繼生，劉誌恒，梁麗糯，等. 放線菌研究及應用［M］. 北京：科學出版社，1990：2～18.
［4］ 曹理想，田新莉，周世寧. 香蕉內生真菌、放線菌類群分析［J］. 中山大學學報，2003，42(2)：70～73.
［5］ 宋子紅，丁立孝，馬伯軍，等. 花生內生菌的種群及動態分析［J］. 植物保護報，1999，26(4)：309～314.
［6］ Igarashi Y, Ogawa M, Sato Y, et al. Fistupyrone, a novel inhibitor of the infection of Chinese cabbage by Alternaria brassicicola, from Streptomyces sp.［J］. J Antibiot (Tokyo),2000,53(10):1117～1122.
［7］ Pullen C, Schmitz P, Meurer K, et al. New and bioactive compounds from Streptomyces strains residing in the wood of Celastraceae ［J］. Planta,2002,216(1):162～167.
［8］ Castillo U F, Strobel G A, Ford E J, et al. Munumbicins, widespectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans ［J］. Microbiology,2002,148(9):2675～2685.
［9］ 田新莉，曹理想，楊國武，等. 水稻內生放線菌類群及其對宿主病原菌的抗性研究［J］. 微生物學報，2004，44(5)：641～645.
［10］ 古強，劉寧，邱旦恒，等. 植物葉片內生放線菌的分離、分類與拮抗活性［J］. 微生物學報，2006，46(5)：778～782.
［11］ 劉寧，張輝，鄭文，等. 藥用植物內生放線菌的生物活性及菌株D62的代謝產物分析［J］. 微生物學報，2007，47(5)：823～827.
［12］ Stierle A, Strobel G, Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific yew ［J］. Science,1993,260(5105):214～216.
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