應用不同培養基檢測單增李斯特菌結果比較

    據中國預防醫學科學院流行病學微生物學研究所的報告顯示，單核細胞增生李斯特菌 ( Listeria monocytogenes，單增李斯特菌) 已經成為2 1世紀可能對中國人衛生健康有重大影響的病原微生物之一。該菌廣泛分布於環境中，由該菌引起的汙染是一個典型的環境衛生問題。 

    世界衛生組織關於單增李斯特菌食品中毒的報告中指出，4％-8％的水產品、5%-10％的乳及乳製品、30％以上的家禽均被該菌汙染。由於該菌在4 ~ C冰箱保存的食品中也能生長繁殖，使其危害性更進一步增大。據報道，約85％-90％的病例是由被汙染的食品引起的。為此，各國均建立了單增李斯特菌標準檢測方法和快速檢測方法，顯色培養基作為快速方法中的一種，已經越來越多地被運用。法國A ES  Laboratoire 和 CHROMagar 公司已有商品化的培養基，並得到了諸如FDA 、ISO等標準化組織的正式批準。本實驗觀察上述2種顯色培養基與傳統方法比較，樣品中單增李斯特菌的菌落特征以及快速檢測的敏感性和特異性。 

 

1 材料與方法

1.1材料

 

1.1.1菌株來源 標準菌株( 英諾克李斯特菌) 由本中心菌種保藏室提供； 試驗菌株來自食品檢測樣品，主要包括：奶製品、肉製品、海鮮類產品和蔬菜，共計2 6 8份。 

 

1.1.2培養基 傳統培養基 MMA、 OXA由本中心培養基室製備。顯色培養基ALOA出自法國A E S  L a b o r a t o i r e 公司， C H R O M a g a r   L i s t e r i a出自法國 C H R O Ma g a r 公司。所有培養基均在有效期內配製並使用。 

 

1.2方 法

 

1.2.1標準菌株 取標準菌株酪腖大豆酵母浸膏肉湯( T S B—Y E) 培養物，分別劃線接種於 M MA 、O X A、A L O A和C H R O Ma g a r  L i s t e r i a 培養基平板上，3 5℃培養2 4-4 8 h ，觀察菌落生長特征。 

 

1.2.2檢測樣品   每份樣品取2 5 g ( 或2 5 m L ) ， 加入225 m L 改良緩衝蛋白腖 ( M B P) ， 固狀樣品高速均質1-2 m i n ，充分振搖製成1 ：1 0樣 品， 3 0℃培養 1 8—2 4 h 。  移取1 m L ， 轉種於 1 0 0 m L增菌培養液( E B ) 中， 3 0℃培養2 4 h和 4 8 h 。分別取增菌液一環 ， 劃線接種於 MM A、 O X A、 A L O A 和 C H R O M a g a r   L i s t e r i a培養基平板上， 予 35℃培養2 4-48 h 。挑取可疑菌落， 劃線接種到胰酪腖大豆酵母浸膏瓊脂( T S A— Y E ) ， 置於3 5℃純培養 2 4 h ； 另轉種於 T S B—Y E置於3 5 ℃純培養 2 4 h ， 進行鑒定實驗。最後， 以A P I —L i s t e r i a 板條和 B溶血試驗作最終確認。 

 

2 結果

 

2.1菌落特征

李斯特菌屬細菌( L i s t e r i a  s p p ． ) 與單增李斯特菌在M MA和OX A上很難區分， 而在 C H R O Ma g a r   L i s t e r i a和A L O A上由於 L i s t e r i a   s p p ． 缺少明顯的暈圈，很容易與單增李斯特菌區分開來。A L O A上單增李斯特菌的菌落特征較為明顯，C HRO Ma g a r   L i s t e r i a上細菌大小差異較大，較大菌落邊緣粗糙，不透明暈圈也沒有 A L O A上的明顯( 見表 1 ) 。 

 

表1   單增李斯特菌及李斯特菌標準菌株在不同培養基上的菌落特征

 

2.2 鑒定情況

由於顯色培養基上單增李斯特菌有明顯的不透明暈圈， 故在C HRO Ma g a r  L i s t e r i a和 A L O A上檢 出的 L i s t e r i a s p p ． 不包括單增李斯特菌，可疑菌落最終被確定為單增李斯特菌的概率為 97.8％和 100.0％， 而 MMA和 OXA 分別 隻 有 27.9％ ( 3 9／1 4 0)和 28.5％ ( 4 5／1 5 8) 。 C H R O M a g a r   L i s t e r i a 培養基上有 1例單增李斯特菌的可疑菌落最終被排除 ， 經確認為綿羊李斯特菌( 見表 2 ) 。 

 

表 2 單增李斯特菌可疑菌落在不同培養基中的鑒定情況

 

    在268 件食品樣品中檢出單增李斯特菌45件，檢出率為16.8 ％。A L O A和 O X A均檢出了這45件單增李斯特菌；HROMa g a r  L i s t e r i a檢出4 4件， MMA檢出 39件 ( 見表3 ) 。顯色培養基與傳統培養基的結果有良好的一致性(  χ²= 0.09 ， P> 0.05) 。除了單增李斯特菌以外的 L i s te r i a   s p p ． 中， 英諾克李斯特菌的汙染率較高， 在MMAOX A、 CHROMag a r   L i s t e r i a和 AL OA上分別 占 100.0％( 1 0 1／1 0 1 )、 98.2％ (1 1 1 ／ 1 1 3 ) 、 86.7％ ( 1 3 ／ 1 5) 和 95.2 ％( 2 0／2 1 ) 。 

 

表 3     2 6 8件樣品在不同培養基檢出李斯特菌的結果 比較

*：因大部分樣品的試驗周期較長( 一般超過 3個月) ， 故單增李斯特菌的汙染率較高

 

3 討論

     傳統培養基檢出單增李斯特菌一般需要 5～7 d ，而使用顯色培養基一般隻需要4 d ， 陰性樣品( 無菌落生長)2d就可以排除。傳統培養基隻能確定可疑菌落為李斯特菌屬， 然後再通過一定的生化試驗檢出單增李斯特菌。這個過程使檢測周期延長，且增加了實驗的花費。而顯色培養基可直接從視覺上判讀，克服了上述的缺點。 

     OX A是以水解七葉苷為主要反應，李斯特菌屬大多能水解七葉苷，故傳統培養基不能很好地區分單增李斯特菌和其他種。C H R O Ma g a r   L i s t e r i a的作用原理是其含有D L一丙氨酸 一1 3一萘胺和 D一丙氨酸 一對硝基苯胺2種底物， 除了單增李斯特菌以外的其他李斯特菌屬細菌均含有分解這2種底物的酶， 因此可快速鑒別單增李斯特菌和其他李斯特菌。A L O A則是利用單增李斯特菌所特有的磷脂酶作用於相應的底物，使之釋放出顯色基團，從而區分單增李斯特菌和其他種。

英諾克李斯特菌是一種對人體非致病的李斯特菌，在顯色培養基上可以較好地區分它和單增李斯特菌。C H R O M a g a r   L i s t e r i a上 單增李斯特菌伴有白色暈圈；A L O A上單增李斯特菌菌落周圍也有一明顯的不透明暈圈，而英諾克李斯特菌則沒有相應的暈圈。C H R O Ma g a r L i s t e r i a上英諾克李斯特菌檢出1 3件( 86.7 ％) ， 在 AL O A上為20件( 95.2 ％) 。而在 MMA上檢出 1 0 1件， OXA上檢出1 1 1件 ， 分別占可疑樣品數的7 2.1％( 1 0 1／1 4 0) 和70.3％( 1 1 1 ／1 5 8 ) ， 構成了可疑樣品數的主要部分。顯色培養基上英諾克李斯特菌可以直接與單增李斯特菌相區分，故單增李斯特菌的檢出率大大提高。在M M A 和OX A上難 以與單增李斯特菌相區分，需進行進一步的生化試驗加以區別。加之所占比例較高，所以對單增李斯特菌檢出造成一定的困難。雖然 OX A最終也將4 5件單增李斯特菌檢出， 但比起顯色培養基增加了相當的工作量和檢測周期。英諾克李斯特菌在選擇性增菌肉湯中的生長對單增李斯特菌會產生一定的影響，因其會產生一種類似抗生素的物質來抑製單增李斯特菌的生長，故在肉湯中處於生長的相對優勢，從而對單增李斯特菌的檢出會起到一定的反作用。由於在顯色培養基上單增李斯特菌能很好被區分開來，可以較大程度地避免常規方法中用溶血試驗來區分單增李斯特菌和英諾克李斯特菌。 由於溶血試驗的結果判讀受主觀因素影響較大，因此會對結果產生一定的影響。

    在C H R O M a g a r   L i s t e r i a 上綿羊李斯特菌表現出與單增李斯特菌相同的菌落形態，故無法從視覺上區分這 2 種細菌。但綿羊李斯特菌在環境中出現的概率非常低，對 C H R O Ma g a r   L i s t e r i a 上可疑菌落檢出單增李斯特菌不會造成太大的影響。