豬鏈球菌分離鑒定及藥敏試驗

    豬鏈球菌是一種人畜共患的傳染性疾病，有 I、 I I 兩個型， 其中I I 型最多見，可致豬腦膜炎、關節炎、肺炎、心內膜炎、多發性漿膜炎、流產和局部膿腫。本菌主要通過創口感染人，引起人鏈球菌中毒性休克綜合征( STSS ) 和鏈球菌腦膜炎綜合征( SMS ) ，給養豬業及公共衛生構成了嚴重的威脅。2007年春，吉林省某豬場豬群相繼發生了一種以高熱、 跛行、神經症狀為特征，致死率極高的急性敗血性傳染病，筆者采集了病、死豬病料分離到 1株細菌，通過培養特性、菌體形態、菌落形態、染色特性、生化試驗、血清學試驗、菌體脂肪酸分析、動物致病性試驗等係統鑒定，確定為豬鏈球菌I I 型。並經藥物敏感試驗，采取措施控製了疫情，現將結果報告如下。 

1 材料與方法

1.1病料來源

采自吉林省某豬場病死豬的病變肺髒、心血、腸係膜淋巴結、肝髒、心包液和病變關節液。 

1.2主要試劑及儀器

鮮血瓊脂、普通瓊脂、 麥康凱瓊脂、 半固體糖發酵培養基、 血清肉湯培養基、 匹克氏增菌液按常規方法製備。 豬鏈球菌 I I 型診斷血清購自荷蘭 DL O公司。質控菌株ATCC49619、ATCC25922購自中國藥品生物製品鑒定所。青黴素鉀、鏈黴素、慶大黴素、頭孢拉定、複方新諾明、萬古黴素、氨苄青黴素、氨苄西林、環丙沙星、利福平、紅黴素、 克林黴素和羅紅黴素等l3種藥敏紙片分別購自上海衛生技術服務公司生物試劑所和北京天壇藥物技術開發公司。 

1.3實驗動物

小白鼠、3 0日齡仔豬 ( 吉林農業大學實驗動物中心提供) 。 

1.4細菌的分離與鑒定

1.4.1細菌的分離  將所采病料分別塗片，革蘭氏染色鏡檢，然後無菌采取病料於鮮血瓊脂平板上劃線分離，3 7℃有氧條件培養24 h ， 可疑菌落接種於匹克氏增菌液， 3 7℃培養24 h ，挑取單個菌落經塗片、染色、鏡檢，證實為純培養物，將其接種於鮮血瓊脂斜麵上進行培養，得到純培養物。 

1.4.2形態結構、 染色特性與運動性檢查按常規方法進行。   ． 

1.4.3培養特性試驗分離菌接種於血清肉湯、普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板，麥康凱瓊脂平板等培養基中，3 7℃有氧條件下培養觀察其生長表現。同時另一組置於厭氧罐中3 7℃培養觀察其生長表現。 

1.4.4生化試驗 用分離菌純培養物進行蔗糖、山梨醇、棉實糖、葡萄糖、甘露醇、蕈糖、乳糖、菊糖、水楊苷、馬尿酸鈉試驗。 

1.4.5血清學試驗  玻片凝集試驗： 將純菌經緩衝肉湯培養8 h ， 通過3 0 0 0 r ／mi n離心 1 0mi n ， PBS洗滌2次， 用pH7．2的0.0 1 mo l ／L  PBS 製成 1×10¹⁰  ～2×10¹⁰ 細菌懸液。取1滴上述細菌懸液與適當的抗血清在潔淨玻片上混勻， 立即觀察凝集現象。 同時，設立細菌懸液對照及血清對照。 

1.4.6 動物致病性試驗

1.4.6.1小白鼠感染試驗用5隻2 0 g 左右重的小白鼠腹腔接種分離菌血清肉湯培養物0.2   mL ( 2×10⁷ C F U／ mL ) ，另設5隻分別腹腔注射0.2 mL血清肉湯作對照。對注射後的小白鼠隔離飼養，觀察其發病及死亡情況，對死亡的立即解剖，無菌采取肝髒、脾髒病料，塗片，革蘭氏染色，鏡檢。並在鮮血瓊脂平板上劃線分離培養。 

1.4.6.2動物回歸試驗   30日齡斷奶仔豬6隻，分成兩組， 一組腹腔注射2 mL分離菌( 含2×1 0⁷ C F U／m L)血清肉湯培養物。另一組腹腔注射2 mL無菌血清肉湯作對照。觀察仔豬發病及死亡情況，對死亡的立即解剖，觀察其病理變化。無菌采取肝髒、脾髒病料，塗片， 革蘭氏染色，鏡檢。並在鮮血瓊脂平板上劃線分離培養。 

1.5紙片擴散法藥敏試驗

將純菌株接種到馬丁瓊脂斜麵， 37℃培養 18～24 h 後用滅菌生理鹽水洗下，並稀釋菌液使其含菌數為 1.5× 10 ⁶ 個／mL 。用滅菌棉拭子挑取菌液在瓊脂平板上向一個方向均勻塗布，然後將平板每轉動 6 0。塗布 1次，共塗3次，最後沿平板邊緣塗布一圈。加蓋後放置5 mi n ， 待平板稍幹後用鑷子將藥敏紙片平放在平板上，並輕壓使其緊貼平板表麵。 每個平板貼 4張藥敏紙片， 兩紙片相距25 mm， 紙片與平板邊緣不小於15 mm， 貼好紙片的平板於3 7℃培養1 8 h後觀察結果。  

2 結果

2.1細菌鑒定

2.1.1 細菌分離結果從病死豬肺髒、心血、肝髒、腸係膜淋巴結均分離到一株具有α溶血的純細菌培養物。 

2.1.2形態結構及染色性 分離菌為革蘭氏陽性，菌體呈圓形，多呈雙球形或短鏈狀，液體培養物中鏈較長， 一般由8～ 15個球菌排成鏈狀，無鞭毛，無芽胞，不運動，無莢膜，無粘液層，無兩極著色現象。

2.1.3培養特性  分離菌為兼性厭氧菌，無運動性：在普通營養瓊脂平板上生長極貧瘠，培養2 4 h後僅在劃線處見有針尖大小的菌落；血清肉湯中血清肉湯渾濁，不形成菌膜，培養48 h後上清較透明，底部有顆粒狀沉澱。在血瓊脂平板上生長好， 37℃、2 4 h 即能長出灰白色、圓形、透明、閃光、中央隆起、表麵光滑露珠狀小菌落，菌落周圍呈α溶血：在麥康凱瓊脂平板上不生長。 

2.1.4生化試驗結果( 見表 1 ) 表中表明分離細菌的生化反應結果均符合豬鏈球菌的生化特性，說明分離的菌均為豬鏈球菌。 

表 1 分離菌生化試驗結果

 

2.1.5血清學試驗 將細菌懸液與 I ／I I 及 I I 型抗血清混合， 立即可見明顯的凝集現象，但不與 I型 及其他型抗血清出現凝集。直接挑取細菌菌落與血清混勻，也能得到一致結果。 陰性對照均未見凝集現象。 

2.1.6致病性試驗

2.1.6.1 分離菌對小白鼠致病性  小白鼠於感染後5 h開始死亡，至15 h全部死亡。死後解剖可見肝、脾、腎腫大，胸腔積液，用心血及胸積液塗片革蘭氏染色鏡檢，發現有大量單個、 成對或4～2 0個左右的短鏈革蘭氏陽性球菌。對照組小白鼠未見異常。 

2.1.6.2動物回歸試驗  腹腔感染仔豬於接種後24 h開始死亡，至48 h全部死亡。 剖檢，空腸、回腸嚴重充血、出血 ，心肌、肺髒出血，胸腔積液，積液塗片革蘭氏染色鏡檢，可見大量單個成對或成長鏈的革蘭氏陽性球菌。對照組仔豬表現正常。通過以上鑒定，確定此菌為豬鏈球菌I I 型。 

2.2藥敏試驗

分離菌株對萬古黴素、氨苄西林、頭孢拉定、利福平、羅紅黴素高度敏感，對青黴素鉀、 氨苄青黴素中度敏感，對鏈黴素、慶大黴素、紅黴素、複方新諾明、 環丙沙星、克林黴素不敏感。 

2.3疾病控製

采取飼養環境和飼料消毒、發病豬隔離、氨苄西林和利福平配合治療等措施，有效地控製了疫情，未發生人的感染。  

3 討論

3.1鑒於 I I 型豬鏈球菌感染不僅造成大量豬的死亡， 也因可引起急性高死亡率的人STSS 和SMS 而頗受關注。為了能及時發現並控製豬群中I I 型豬鏈球菌感染，疑似病、死豬標本中的I I 型豬鏈球菌分離及鑒定是至關重要的病原學依據。實驗結果表明，在分離菌落的基礎上，采用豬鏈球菌 I I 型診斷血清的玻片凝集試驗能快速鑒定豬鏈球菌，且具有簡便、 廉價、 準確等優點。

3.2從理論上講，豬鏈球菌的抵抗力不強，治療上很多藥物都應有效，但從藥敏試驗及臨床治療來看，常用藥物的敏感性很低，多表現耐藥，所分離病原菌表現多重耐藥性，這與本實驗室 2 0 0 1 年在同一地區所做的同一試驗結果存在著較大差異，這主要與濫用藥物及用藥習慣有關。 因此，對於鏈球菌病的治療早期可采用2～ 3 種藥物試驗性治療，最好在藥敏試驗基礎上合理用藥。使用藥物預防時應避免長期使用同一種藥物， 可幾種藥物交替使用。

3.3 近幾年來，在我國部分省、市爆發流行豬鏈球菌 I I 型，對人的健康造成了嚴重危害。因此，飼養員、獸醫、管理人員以及屠宰場工人等接觸病豬、剖檢死亡豬和處理汙染物時要特別注意自身的防護，防止被感染。