(1)試料和初始懸浮液(首次稀釋液)的製備
按重量或體積稱取或量取試料,放入滅菌容器或塑料袋中,允許誤差為±5%。一定量的試料(至少10g或10mL,或標準方法另有規定)應能代表用於檢測的實驗室樣品。需指出,使用大於最低要求重量或體積的試料可提高定量檢測結果的可靠性。
加入9倍於試料重量或體積的稀釋液,以製成10倍稀釋樣液。稀釋液最好按質量計量,也可按體積計量,允許誤差不得超過±2%。針對某些特定的檢測項目,可酌情降低或增加稀釋液比率,允許誤差亦為±2%。為避免因溫度的驟然變化而損傷目標微牛物,除非對特定產品的特殊規定,所有稀釋液的溫度應與實驗室室溫大致相同、按標準要求均質樣品和稀釋液的混合物,如有必要,可靜止不超過15min,以讓大顆粒物質沉澱,或采用濾過係統去除此類物質,例如使用帶濾膜的塑料樣品袋。
某些種類的產品若按1∶10稀釋製備可能形成較為黏稠或濃厚的懸浮液,影響後續操作,這些情況下可按1:20、1:50及1:100等稀釋比率添加稀釋液，直至形成適用於後續試驗的懸浮液。這些非標準化的稀釋比率應換算到後續操作中,尤其是進行計算和結果表述時。另一些情況下,當檢測樣品中較低數量的微生物,且受試樣品可製成適宜的初懸液時，可能需要製備1:2或1 :5等較低的稀釋比率。然而需注意的是,使用低稀釋比率的初始懸浮液,在後續轉種至液體培養基或固體培養基時可能造成樣品基質與培養基比例的不平衡(如食品組分濃度的相應增高會抑製目標微生物的生長),因此低稀釋液比率需謹慎使用,並需按具體的案例逐個進行驗證。
進行芽孢計數時,應在初始懸浮液製備後立即進行熱處理,如在80℃±5℃,維持10min±1min,然後迅速使用流動冷水浴等冷卻懸浮液,以盡量減少對目標微生物芽孢的損耗。
(2）操作持續時間
從初始懸浮液製備完成到整體接種操作完成,其間不得超過45min。從製備懸浮液到製備後續稀釋液間不得超過30min。若實驗室環境溫度偏高,超過了建議範圍(>27℃),則稀釋操作的持續時間應相應縮減,盡量避免可能因微生物的增殖導致計數檢測結果偏高。
某些標準方法中要求稀釋時有一個複蘇期,以盡量修複受損傷的微生物,此複蘇期應從初始懸浮液製備完成開始計算,結束後應立即開展後續稀釋步驟。
(3）常用稀釋液的相關要求
為提高微生物檢測結果的再現性,建議使用商品化的即用稀釋液或幹粉培養基,並嚴格按使用說明進行配製和使用。培養基的化學成分應為分析純並適用於微生物檢測﹐配製用水應符合要求。各種稀釋液應符合再現性要求,標準為添加一定數量的指定微生物(如大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌),在實驗室環境溫度(18℃~27℃)下培養45min~1h後,菌落計數結果應不超過初始計數結果的±30%。
用於計數檢測的初始懸浮液,經分裝滅菌後的最終液量與標準規定的允許誤差不得超過士2%。為確保達到此允許誤差,宜將大體積的稀釋液滅菌後再精確地無菌分裝。
ISO 6887-1中規定的通用稀釋液有以下幾種:
① 蛋白腖鹽溶液(酶消化酪蛋白1.0g,NaCl 8.5g,水1000mL。在水中溶解各組分,分裝,滅菌,pH7.0±0.2);
② 緩衝蛋白腖水(蛋白腖10.0g,NaCl 5.0g,Na2HPO4·12H2O 9.0g,KH2PO41.5g，水1000mL。在水中溶解各組分,分裝,滅菌,pH7.0±0.2);
③ 雙料緩衝蛋白腖水,用於高酸性產品(將雙份緩衝蛋白腖水的成分溶解於1000mL水中,分裝,滅菌,pH7.0±0.2)。
GB 4789《食品安全國家標準食品微生物學檢驗》係列標準中規定的稀釋液為以下兩種:
① 生理鹽水(稱取8.5g NaCl溶於1000mL蒸餾水中,121℃高壓滅菌15min);
② 磷酸鹽緩衝液(貯存液:稱取34.0g的KH2PO4溶於500mL蒸餾水中,用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.2,用蒸餾水稀釋至1000mL後貯存於冰箱。稀釋液:取貯存液1.25mL,用蒸餾水稀釋至1000ml,分裝於適宜容器中,121℃高壓滅菌15min)。
黴菌和酵母計數檢驗中規定除生理鹽水和磷酸緩衝液,也可使用無菌水作為樣品稀釋液。
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