GB 14963—2011
附錄A
嗜滲酵母計數
A.1 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
A.1.1 恒溫培養箱：25℃±1 ℃。
A.1.2 冰箱：2℃～5 ℃。
A.1.3 均質器及無菌均質袋、均質杯或滅菌乳缽。
A.1.4 天平： 感量0.1g。
A.1.5 無菌試管：18mm×180 mm。
A.1.6 無菌吸管：1mL（具 0.01mL 刻度），10 mL（具 0.1mL 刻度），或微量移液器及吸頭。
A.1.7 無菌錐形瓶：500mL，250mL。
A.1.8 無菌培養皿：直徑 90mm。
A.1.9 無菌 L 型塗布棒：玻璃、塑料或者不鏽鋼材料製成，棒體直徑不應大於 2 mm。
A.1.10 顯微鏡： 10×～100×。
A.2 培養基和試劑
A.2.1 30％葡萄糖溶液（pH 6.5±0.5）
A.2.1.1 成分
無水葡萄糖 30.0g
蒸餾水 100mL
A.2.1.2 製法
稱量適量葡萄糖，溶解在蒸餾水中，必要時調節 pH 為 6.4左右。分裝後，115℃高壓滅菌 20min。
A.2.2 氯硝胺 18%甘油（ DG18）瓊脂
A.2.2.1 成分
酪蛋白腖 5.0g
無水葡萄糖 10.0 g
磷酸二氫鉀 1.0g
硫酸鎂（MgSO4·H2O） 0.5g
氯硝胺 0.002g
無水甘油 200g
瓊脂 15g
氯黴素 0.1g
蒸餾水 1000mL
A.2.2.2 製法
除氯黴素外，將全部成分加熱煮沸至完全溶解，如有必要，調節 pH 為 6.4左右。加入抗菌素，121 ℃高壓滅菌 15 min，最終的 pH 應為 5.6±0.2。滅菌後，立即在 44 ℃～47℃水浴冷卻至 50 ℃以下，在每個滅菌平皿中傾注大約 15 mL～20mL 培養基，放置在水平的台麵上冷卻固化備用。如有必要，可以放在 36℃培養箱中過夜，使瓊脂表麵幹燥無水珠。避光保存。
A.3 檢驗程序
A.4 操作步驟
A.4.1樣品采集和保存
樣品采集後，應盡可能及時檢驗。若不能及時檢驗，普通樣品應置 2℃～5℃冰箱保存，在 24h 內檢驗。冷凍樣品應在 45℃以下不超過 15min 或在 2 ℃～5 ℃不超過 18 h解凍。
A.4.2 樣品稀釋
A.4.2.1 取樣
以無菌操作在天平上稱取固體或液體檢樣 25 g，加入 30％葡萄糖稀釋液 225g，用旋轉刀片式均質器以 8000 r/min 均質 1min，或拍擊式均質器拍擊 2 min，製備成 1:10 的均勻稀釋液。如無均質器，則將樣品放入加有玻璃珠的無菌錐形瓶中，並充分振蕩。
A.4.2.2 梯度稀釋
用滅菌吸管吸取 1:10 稀釋液 1mL，注入含有 9mL 30％葡萄糖稀釋液的試管內，置於漩渦混懸儀上混勻，製備 1:100的稀釋液。另取 1mL 滅菌吸管，按前操作依次製備 10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1 支 1 mL 滅菌吸管。
A.4.3 塗布和培養
A.4.3.1 根據對檢樣汙染情況的估計，選擇 2個～3個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度接種 2個 DG18 瓊脂平板。在充分混合稀釋液之後，立即在每個平板表麵接種 0.1mL，接著用無菌的 L 型塗布棒進行充分的瓊脂表麵塗布。注意塗布棒下端不得觸碰培養皿的側緣。進行樣品檢驗的同時，應同時在2 個 DG18 瓊脂平板表麵接種 0.1mL 的稀釋液作為空白對照。
A.4.3.2 接種完成後，盡快將全部平板置 25 ℃±1 ℃恒溫箱內避光培養。培養時勿翻轉培養皿。為防止出現黴菌的過度蔓延生長掩蓋了目標菌落，在培養 48 h後，即開始每日觀察平板上麵真菌生長情況。培養 7 d結束。
A.4.4 菌落計數
A.4.4.1 選擇菌落數量在 15～150之間的平板，計數菌落數量。
A.4.4.2 典型的嗜滲酵母在 DG18 瓊脂平板上呈現為圓形、中心隆起、不透明、邊緣整齊的菌落，直徑 1 mm～2 mm。必要時，可利用低倍顯微鏡直接觀察平板上生長的菌落是否為細菌菌落。如出現黴菌菌落幹擾時，不應計數絲狀菌落。
A.4.5 報告
參照GB 4789.2的報告方式，以 CFU／g 為單位報告樣品中嗜滲酵母的數量。
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