病毒感染病原學診斷在疾病的預防上可了解流行病學情況，疫苗的免疫效果以及采取及時的免疫措施及必要的隔離和防護，在病毒感染的診斷和治療上可避免不必要的診斷檢查，避免濫用抗生素。對某些病毒疾病可選用有效的抗病毒藥物，如用阿糖腺苷或無環鳥苷治療單母子皰疹腦炎，丙氧鳥苷治療嚴重的巨細胞病毒感染，病毒唑霧化吸入治療呼吸道合胞病毒肺炎，齊多夫定、AZT治療愛滋病等。對一些病毒感染可進行預後判斷，如沒有得到及時抗病毒治療的單純皰疹腦炎病人預後極差，肝炎病人長HbeAg陽性者預後不良。
一、常用實驗方法
1．病毒分離常用方法：用活細胞、組織、胚胎或動物分離病毒。細胞培養分離病毒主要過程：細胞培養，病毒分離和病毒鑒定。基本原理：病毒在活的敏感細胞、組織、胚胎或動物體內複製繁殖。意義：從病變部位（活檢組織、腦脊液、皰疹液、體腔積液）或血液中分離到病毒的診斷意義很大。從糞便中分離到病毒（如巨細胞病毒，腸道病毒等）的意義應結合其它病毒學檢查結果（如抗病毒抗體等）來判定。
2．電子顯微鏡直接檢查病毒常用方法：普通電子顯微鏡檢查，免疫電子顯微鏡檢查。基本原理：標本經負染處理後，根據病毒顆粒的形態作出判斷。意義：能根據病毒顆粒的形態診斷，如輪狀病毒、腺病毒、甲型肝炎病毒、星狀病毒等。
3．檢測病毒的抗原成分常用方法：對組織或細胞內的病毒成分可用免疫熒光染色、免疫酶染色等；對細胞外的或可溶性的病毒成分可用方法有：凝集試驗、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、放射免疫、免疫滲濾層析試驗（膠體金）等。基本原理：抗病毒抗體致敏的血球或吸附抗病毒抗體的載體顆粒與病毒結合；病毒抗原和抗體在凝膠中相遇形成沉澱線； 標記的抗病毒抗體與相應的病毒抗原結合或反應，通過某種指示係統顯示病毒抗原的存在。意義：對大多數病毒而言，病毒抗原陽性一般可作為診斷急性病毒感染的依據。但對有些病毒（如巨細胞病毒，受滋病毒，乙肝病毒），病毒抗原陽性常不能說明宿主的感染狀態，如急性、慢性或攜帶狀態。該方法能用於早期快速診斷病毒感染，特別適用於臨床。
4．病毒血清學常用方法：中和試驗、補體結合試驗、血凝抑製試驗、免疫熒光、免疫酶染色、ELISA、化學發光、時間分辨免疫熒光、熒光偏振、膠體金。基本原理：抗原和抗體特異性地結合或反應，通過某種指示係統顯示病毒抗體的存在。意義：恢複期血清中抗病毒抗體滴度≥4倍升高有診斷意義； 血清抗病毒IgM抗體陽性可作為診斷該病毒近期感染的依據。
5．基因診斷（檢測病毒遺傳物質，如PCR）常用方法：PCR、套式或巢式PCR、逆轉錄PCR 基本原理：在體外條件下（至少1對DNA引物，dNTP，緩衝液）DNA聚合酶催化合成與模板DNA互補的新鏈。意義：病毒核酸陽性一般可作為診斷病毒感染的依據，但對有些病毒（如巨細胞病毒，愛滋病毒，乙肝病毒），不能說明宿主感染狀態，如急性、慢性或攜帶。由於PCR的敏感性非高常，實驗條件要求嚴格，根據PCR試驗結果有時尚不能確定病毒或現疾病的關係，該技術在檢測不同標本，診斷不同病毒性疾病中的意義有待進一步評價。
二、常用實驗方法的評價
1．病毒分離優點：是診斷病毒性疾病的金標準，特異性強，能發現新病毒，反應傳染性，可在試驗動物中驗證。缺點：耗時長，一般隻能做回顧性診斷，成本和技術要求高，敏戌性不高，有些病毒無法或極難培養，不同的病毒需要不同的分離方法。發展方向：短時細胞培養加免疫熒光或免疫酶染色法快速檢測病毒抗原。
2．免疫熒光或免疫酶染色法優點：能檢測細胞內的抗原，需要相對較少的細胞，固定後的標本可存放相當長的時間，能顯示病毒抗原的組織學和細胞學分布特點。免疫酶染色法不需要熒光顯微鏡。工作人員需有豐富的經驗，試驗結果可能受主觀因素的影響。免疫酶染色有可能受內源性酶的影響出現假陽性。間接法的敏感性比直接法的敏感性高，但特異性稍低。
3．ELISA 優點：可用機器判讀結果，便於自動化和一次性檢測大量標本，檢測病毒抗體的敏感性比免疫熒光法或免疫酶法高。缺點：檢測抗原時，與免疫熒光法相比，敏感性較低，一般隻能檢測可溶性病毒抗原。發展方向：重組抗原，捕獲法。
4．化學發光法優點：正常用免疫學方法中最敏感，判斷結果較客觀，可自動化，一次可檢測大量標本。缺點：多為進口產品，試劑和儀器較貴。
5．電子顯微鏡優點：可直接檢測標本；能發現新病毒；能直觀地顯示組織或細胞內的病毒。可用於檢測極難分離的病毒。缺點：機器價格昂貴，技術要求高，不太適用於常規病毒學診斷試驗或大量標本的檢測；病毒量較大時才易得到陽性結果，應用範圍有限，且不能鑒別病毒的血清型。
6．基因診斷，如PCR 優點：敏感、特異，是目前使用的病毒學診斷技術中最敏感的技術方法；一次可檢測 較大量標本；能檢測出與宿主細胞基因組整合的病毒核酸序列；可用於檢測目前不能或不易分離的病毒。缺點：對診斷未知病毒的感染無能為力，被檢測的病毒核酸序列必須已經清楚；需要較多儀器設備，試驗成本較高；有試驗汙染的可能性。發展方向：雜交PCR，定量PCR
三、質量控製
買病毒診斷試劑盒時，應檢查是否經過評價。每次做試驗時都必須設對照，包括陽性對照和陰性對照。不宜漫無目標地做過多的病毒學試驗，避免由於假陽性結果或與現疾病無直接關係的試驗結果幹擾或延誤診治病人。某些病毒有血清學反應的交叉（如副流感病毒與肋腺炎病毒，艾可病毒與林薩廳病毒，乙型腦炎與登革熱病毒等）。用單克隆抗體檢測病毒抗原能提高試驗特異性，但有假陰性的可能。理論上說，用混合單克隆抗體檢測病毒抗原，診斷病毒感染較好。用病毒學試驗來排除病毒感染的可能性並不總是可靠的。用不同技術方法測得的抗病毒抗體滴度差異很大。臨床醫師應認直分析病毒學試驗的結果，並采取合理的診療措施。
采集標本一般要求做到早：特別是對病毒分離、抗原或核酸檢測。快：盡快檢測新鮮標本，不能及時檢測的標本短時間可低溫保存，用於組織或細胞內病毒抗原檢測的標本應固定後再冷藏保存。凍存的標本忌反複凍融。近：用於病毒分離、抗原或核酸檢測的標本應盡量取自病變部位或接近病變部位（如腦炎取腦脊液，腹瀉取糞便，呼吸道感染取鼻咽分泌物或支氣管灌洗液）。多：標本的量不能太少，如有可能一次取多種標本，在病程急性期和恢複期都取標本。淨：避免汙染標本，特別是用於病毒分離或PCR檢測的標本。
目前，國內已開展病毒實驗診斷室間質量評價，但內容與國外相比要少得多，有條件的實驗室應積極參加國內組織的室間質評計劃，促進病毒實驗診斷檢驗質量的提高。美國CAP開展的病毒實驗診斷室間質評內容
作者：壽好長 金京南
作者單位：北京中醫藥大學東方醫院
上一篇：細胞免疫熒光法檢測H5N1流感病毒抗體
下一篇：新城疫病原分離與鑒定
