新城疫病原分離與鑒定

當臨床診斷有新城疫發生時，應從發病禽或死亡禽采集病料，進行病原分離、鑒定和毒力測定。

1  樣品的采集、保存及運輸

1.1  樣品采集

1.1.1  采集原則。采集樣品時，必須嚴格按照無菌程序操作。采自於不同發病禽或死亡禽的病料應分別保存和標記。每群至少采集5隻發病禽或死亡禽的樣品。

1.1.2  樣品內容

發病禽：采集氣管拭子和泄殖腔拭子（或糞便）；

死亡禽：以腦為主；也可采集脾、肺、氣囊等組織。

1.2  樣品保存

1.2.1  樣品置於樣品保存液（0.01M PBS溶液，含抗生素且pH為7.0～7.4）中，抗生素視樣品種類和情況而定。對組織和氣管拭子保存液應含青黴素（1000IU/mL）、鏈黴素（1mg/mL），或卡那黴素（50μg/mL）、製黴菌素（1000IU/mL）；對泄殖腔拭子(或糞便)保存液的抗菌素濃度應提高5倍。

1.2.2  采集的樣品應盡快處理，如果沒有處理條件，樣品可在4℃ 保存4天；若超過4天，需置-20℃保存。

1.3  樣品運輸

所有樣品必須置於密閉容器，並貼有詳細標簽，以最快捷的方式送檢（如：航空快遞等）。如果在24小時內無法送達，則應用幹冰致冷送檢。

1.4  樣品采集、保存及運輸按照《高致病性動物病原微生物菌（毒）種或者樣本運輸包裝規範》（農業部公告第503號）執行。

2  病毒分離與鑒定

2.1  病毒分離與鑒定：按照GB 16550附錄A3.3、A4.1、A4.2進行。

2.2  病原毒力測定

2.2.1  最小病毒致死量引起雞胚死亡平均時間(MDT)測定試驗

按照GB 16550附錄A4.3進行；

依據MDT可將NDV分離株分為強毒力型（死亡時間≤60小時）；中等毒力型（60小時＜死亡時間≤90小時；溫和型（死亡時間＞90小時）。    

2.2.2  腦內致病指數(ICPI)測定試驗

收獲接種過病毒的SPF雞胚的尿囊液，測定其血凝價>24，將含毒尿囊液用等滲滅菌生理鹽水作10倍稀釋(切忌使用抗生素)，將此稀釋病毒液以0.05mL/羽腦內接種出殼24～40小時的SPF雛雞10隻,2隻同樣雛雞0.05mL/羽接種稀釋液作對照(對照雞不應發病，也不計入試驗雞)。每24小時觀察一次，共觀察8天。每次觀察應給雞打分，正常雞記作0，病雞記作1，死雞記為2（死亡雞在其死後的每日觀察結果都記為2）。

ICPI值=每隻雞在8天內所有分值之和／(10隻雞×8天)，如指數為2.0，說明所有雞24小時內死亡；指數為0.0，說明8天觀察期內沒有雞表現臨床症狀。

當ICPI達到0.7或0.7以上者可判為新城疫中強毒感染。

2.2.3   F蛋白裂解位點序列測定試驗

NDV糖蛋白的裂解活性是決定NDV病原性的基本條件,F基因裂解位點的核苷酸序列分析,發現在112～117位點處, 強毒株為112Arg-Arg-Gln-Lys(或Arg)-Arg-PHe117;弱毒株為112Gly-Arg(或Lys)-Gln- Gly-Arg-Leu117 這是NDV致病的分子基礎。個別鴿源變異株（PPMV-1）112Gly-Arg-Gln-Lys-Arg-PHe117,但ICPI值卻較高。因此，在115、116位為一對堿性氨基酸和117位為苯丙氨酸（PHe）和113位為堿性氨基酸是強毒株特有結構。根據對NDV F基因112-117位的核苷酸序列即可判定其是否為強毒株。 (Arg-精氨酸；Gly-甘氨酸；Gln-穀氨酰胺；Leu-亮氨酸；Lys-賴氨酸)。

分離毒株F1蛋白N末端117位為苯丙氨酸（F），F2蛋白C末端有多個堿性氨基酸的可判為新城疫感染。“多個堿性氨基酸”是指113至116位至少有3個精氨酸或賴氨酸（氨基酸殘基是從後F0蛋白基因的N末端開始計數的，113至116對應於裂解位點的-4至-1位）。

2.2.4  靜脈致病指數(IVPI)測定試驗

收獲接種病毒的SPF雞胚的感染性尿囊液，測定其血凝價>24，將含毒尿囊液用等滲滅菌生理鹽水作10倍稀釋(切忌使用抗生素)，將此稀釋病毒液以0.1mL/羽靜脈接種10隻6周齡的SPF雞，2隻同樣雞隻接種0.1mL稀釋液作對照(對照雞不應發病，也不計入試驗雞)。每24小時觀察一次，共觀察10天。每次觀察後給試驗雞打分，正常雞記作0，病雞記作1，癱瘓雞或出現其它神經症狀記作2，死亡雞記3（每隻死亡雞在其死後的每日觀察中仍記3）。

IVPI值=每隻雞在10天內所有數字之和／(10隻雞×10天)，如指數為3.00，說明所有雞24小時內死亡；指數為0.00，說明10天觀察期內沒有雞表現臨床症狀。

IVPI達到2.0或2.0以上者可判為新城疫中強毒感染。