細菌的生理生化試驗
1 目的
1.1 了解細菌鑒定中常用的生理生化試驗反應原理
1.2 掌握測定細菌生理生化反應的技術和方法
2 原理
各種微生物在代謝類型上表現了很大的差異。由於細菌特有的單細胞原核生物的特性，這種差異就表現的更加明顯。不同細菌分解、利用糖類、脂肪類和蛋白類物質的能力不同，所以其發酵的類型和產物也不相同，也就是說，不同微生物具有不同的酶係統。即使在分子生物學技術和手段不斷發展的今天，細菌的生理生化反應在菌株的分類鑒定中仍有很大作用。
3 材料
3.1 菌種
大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、產氣腸杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通變形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜麵菌種
3.2 培養基
葡萄糖蛋白腖水培養基、蛋白腖水培養基、糖發酵培養基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）
3.3 試劑
40％NaOH溶液、肌酸、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示劑。
3.4 器具
超淨工作台、恒溫培養箱、高壓滅菌鍋、試管、移液管、杜氏小套管。
4 流程
糖發酵試驗→V-P試驗→甲基紅試驗→吲哚試驗
5 步驟
(一) 糖類發酵試驗
1 目的
了解不同細菌分解利用糖的能力及原理
2 原理
可根據細菌分解利用糖能力的差異表現出是否產酸產氣作為鑒定菌種的依據。是否產酸，可在糖發酵培養基中加入指示劑溴甲酚紫（即B.C.P指示劑，其pH在5.2以下呈黃色，pH在6.8以上呈紫色），經培養後根據指示劑的顏色變化來判斷。是否產氣，可在發酵培養基中放入倒置杜氏小管觀察。
3 材料
3.2 菌種
大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、產氣腸杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通變形杆菌（Proteus vulgaris）的斜麵菌種
3.３ 培養基
葡萄糖、蔗糖和乳糖發酵培養液試管
４ 流程
發酵液試管→標記→接種→培養→觀察→記錄
5 步驟
5.1 試管標記
取分別裝有葡萄糖、蔗糖和乳糖發酵培養液試管各 Ａ 不產氣；Ｂ 產氣
4支，每種糖發酵試管中均分別標記大腸杆菌、產氣腸杆菌、普通變形菌和空白對照。
5.2 接種培養
以無菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應試管中，每種糖發酵培養液的空白對照均不接菌。將裝有培養液的杜氏小管倒置放入試管中（圖9-1），置37℃恒溫箱中培養，分別在培養24h、48h、和72h觀察結果。
5.3 觀察記錄
與對照管比較，若接種培養液保持原有顏色，其反應結果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“－”表示；如培養液呈黃色，反應結果為陽性，表明該菌能分解該種糖產酸，記錄用“＋”表示。培養液中的杜氏小管內有氣泡為陽性反應，表明該菌分解糖能產酸並產氣，記錄用“＋”表示；如杜氏小管內沒有氣泡為陰性反應，記錄用“－”表示。
（二） 乙酰甲基甲醇試驗(V．P試驗)
1 目的
了解鑒別不同腸杆菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗原理，並掌握其操作方法．
2 原理
某些細菌在葡萄糖蛋白腖水培養液中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，後者在強堿環境下，被空氣中氧，氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白腖中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應。
3 材料
3.1 菌種
大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、產氣腸杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通變形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜麵菌種
3.2 培養基
葡萄糖蛋白腖培養液的試管
４ 流程
培養液試管→標記→接種→培養→觀察→記錄
5 步驟
5.1 標記試管
取5支裝有葡萄糖蛋白腖培養液的試管，分別標記大腸杆菌、產氣腸杆菌、普通變形菌、枯草芽孢杆菌和空白對照。
5.2 接種培養
以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應試管中，空白對照管不接菌，置37℃恒溫箱中，培養24～48h。
5.3 觀察記錄
取出以上試管，振蕩2min。另取5支空試管相應標記菌名，分別加入3～5ml以上對應管中的培養液，再加入40％NaOH溶液10～20滴，並用牙簽挑入約0.5～1mg微量肌酸，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37℃恒溫箱中保溫15～30min後，若培養液呈紅色，記錄為V.P.試驗陽性反應（用“＋”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗陰性反應（用“－”表示）。
注意：原試管中留下的培養液用作甲基紅試驗。
（三） 甲基紅試驗（M.R.試驗）
1 目的
了解鑒別腸杆菌科各菌屬的甲基紅試驗原理，並掌握其操作方法．
2 原理
腸杆菌科各菌屬都能發酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸，進一步分解中，由於糖代謝的途徑不同，可產生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物，可使培養基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。
3 材料
3.1 菌種
同V．P試驗
3.2 培養基
同V．P試驗
4 流程
培養液→指示劑→觀察→記錄結果
5 步驟
於V.P.試驗留下的培養液中，各加入2～3滴甲基紅指示劑，注意沿管壁加入，仔細觀察培養液上層，若培養液上層變成紅色，即為陽性反應；若仍呈黃色，則為陰性反應，分別用“＋”或“－”表示。
（四）吲哚試驗
1 目的
掌握吲哚試驗(Ehrlich法)的原理和方法
2 原理
有些細菌含有色氨酸酶，能分解蛋白腖中的色氨酸生成吲哚(靛基質)。吲哚本身沒有顏色，不能直接看見，但當加入對二甲基氨基苯甲醛試劑時，該試劑與吲哚作用，形成紅色的玫瑰吲哚。
3 材料
3.1 菌種
測試菌株． 大腸杆菌、產氣腸杆菌、普通變形菌、枯草芽孢杆菌
3.2培養基
蛋白腖水培養基
3.3 試劑
二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。
4 流程
標記試管→接種→培養→觀察→記錄
5 步驟
5.1 試管標記
取裝有蛋白腖水培養液的試管5支，分別標記大腸杆菌、產氣腸杆菌、普通變形菌、枯草芽孢杆菌和空白對照。
5.2 接種培養
以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應試管中，第5管作空白對照不接種，置37℃恒溫箱中培養24～48h。
5.3 觀察記錄
在培養液中加入乙醚1～2ml，經充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻後乙醚層浮於培養液的上麵，此時沿管壁緩慢加入5～10滴吲哚試劑（加入吲哚試劑後切勿搖動試管，以防破壞乙醚層影響結果觀察），如有吲哚存在，乙醚層呈現玫瑰紅色，此為吲哚試驗陽性反應，否則為陰性反應，陽性用“＋”、陰性用“－”表示。
6 結果
記錄生理生化反應測定結果．
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