負染色也叫陰性反差染色。這種染色法是用重金屬鹽類溶液與樣品混合而使樣品呈現出良好的反差。經這種方法染色的生物樣品，在電鏡下是暗背景下的亮物像，與通常的染色性質相反，所以稱之為負染色。負染色原理尚待進一步探討，一般認為是用電子散射力強的重金屬襯出電子散射力弱的物體的像。染色後，染液在病毒的疏鬆處或空隙處滯留，因而在電鏡下病毒的這些部位呈黑色，或者染液將病毒包圍，病毒周圍的背景呈黑色，病毒本身因電子散射力弱而較透明，如圖12-6。早在五十年代,Hall和Huxley等即已應用這種方法於生物大分子的研究，後來由Brenner和Horne等改進成常規方法，並應用於病毒的研究，對病毒學的發展起了相當大的推動作用。它不僅是研究病毒結構的好方法，而且已廣泛用於臨床病毒學診斷。就某些病毒性疾病來說，根據病毒的形態特征，結合患病動物的臨床症狀，即可獲得比較肯定的診斷。依據病毒粒子大小、形態和對稱性而能作為定性診斷的有腺病毒科、皰疹病毒科、呼腸弧病毒科、冠狀病毒科、小RNA病毒科、細小病毒科和痘病毒科等等。 負染色的主要特點是反差強，分辨力高，可以看到病毒的亞單位結構，圖12-7是負染色法看到的輪狀病毒。負染法操作簡便易行，不需特殊設備，且可在較短時間內得出結果。 圖12-6 負染色密度反差原理示意 圖12-7 負染法看到的輪狀病毒 (橫杠＝100nm)——作者原圖 負染色使用的染液有磷鎢酸、磷鉬酸、矽鎢酸和醋酸鈾等。實驗證明，pH68的2％磷鎢酸溶液適用於多種病毒，使用範圍大，因此是最常用的一種染液。具體配製方法：用蒸餾水配成2％的磷鎢酸溶液，以1mol/L的氫氧化鈉或氫氧化鉀調整pH為68，濾過後蓋緊瓶蓋，4℃貯藏，可長期使用。 被觀察材料最好是比較純淨的病毒懸液。感染細胞培養物需反複凍融三次以上或用其它方法使細胞裂解，釋放出病毒粒子。然後3000r/min離心沉澱30分鍾除去細胞碎片，以上清液製片。糞便或組織可加適量緩衝液製成勻漿後，3000r/min離心沉澱30分鍾取上清液製片。粘液性糞便，如果預計是能夠抵抗有機溶劑的病毒，如細小病毒科和呼腸孤病毒科(輪狀病毒)，則可在糞便內按1∶1容量加入氯仿或乙醚，充分振蕩15分鍾後，3000r/min離心沉澱15分鍾，取上清液製片。水泡液、尿液、氣管洗液和腦脊髓液等液體樣品在低速離心沉澱後，取上清液直接製片。 如果液體內的病毒粒子含量太少，不易直接製片檢出，則可應用上述製備的上清液作100000g1小時離心沉澱，傾棄上清，將沉澱懸浮後製片。 染色方法分懸滴法和噴霧法。 1.懸滴法 用毛細管吸取少量病毒懸液，直接滴在有支持膜的網上，懸液在網上呈半球形。數分鍾後，用一片幹淨濾紙從網邊吸去液體。稍幹後用另一毛細管吸一滴染液滴在網上染色數十秒至1分鍾左右。用濾紙吸去染液，立即進行電鏡觀察或置幹燥器內短期保存。 2.噴霧法 將染液與病毒懸液等量混合後，在無菌櫃或防塵罩內用噴霧器將樣品噴到帶膜的載網上。由於霧點較小，常能獲得良好的效果。這種方法的缺點是容易造成病毒擴散。此外，病毒與染液混合時要求溶液的緩衝條件較高，否則可能產生沉澱而影響效果。 染色時應注意下麵幾點： (1)懸液內的被檢病毒要有一定的濃度，太稀和太濃都不易觀察，一般要求以106～1010個病毒粒子/毫升較好。 (2)不同的病毒可用不同pH的染液試染。 (3)染液的濃度與染色時間應視樣品的不同而異。大而疏鬆的樣品，濃度應低些，染色時間短些；小而致密的樣品，染液濃度應適當高些，染色時間長些。一般情況下，遊離病毒粒子用2％磷鎢酸染色的時間為1分鍾左右，某些小型病毒可延長些。 (4)支持膜特別是碳膜呈疏水性，需要時可在懸液內加數滴0005～005％牛血清白蛋白或04％蔗糖等擴散劑，使被檢材料和染液均勻地散布在網上。 (5)用濾紙吸去病毒懸液後，要在肉眼看不出載網上殘留液體時立即滴加染液，否則樣品與染液易形成團塊狀，影響微細結構的觀察。 (6)不同的染液可能會選擇性地顯示樣品的不同結構，所以對每一樣品應使用幾種染液試驗，選擇最好的染液使用之。 (7)染色後要及時觀察或幹燥保存。 (8)觀察時要先用較暗的光斑照射1～2分鍾，再逐漸用強光照射，避免出現支持膜破裂或收縮等現象。 (9)製備每個樣品後，要將夾過銅網的鑷子通過火焰或其他方法徹底清潔，防止不同被檢材料相混。
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