金屬投影和複型-電鏡樣品的基本製備技術　

　金屬投影技術和複型技術的共同特點是采用真空噴鍍儀將某些重金屬物質加熱到熔點以上，形成極細小的顆粒投射到樣品上，產生電子反差。　　金屬投影技術主要用於微顆粒狀生物樣品，如細菌、病毒、原生動物、孢子、分離的微纖絲、蛋白質分子、核酸分子等；複型技術與金屬投影技術有著密切的關係，在掃描電鏡應用前，該法是唯一的一種能用透射電鏡觀察樣品表麵結構的製樣方法。它多用於骨骼、牙齒以及微粒生物樣品等研究。複型法最大優點是由於應用透射電鏡觀察複型結構，其分辨率比掃描電鏡高得多。　　 1.金屬投影　　金屬在真空中蒸發時，金屬粒子將呈直線向四周噴射。如果在與噴射源成一定角度的地方放一物體，那麽，物體朝向噴射源方向的一麵將沉積一層金屬粒子，而背向噴射源的一麵，由於物體的阻擋，無金屬粒子沉積。電鏡觀察時，沉積金屬的一麵增加了物體對電子的散射，從而增大物象的反差。這與光線照射物體形成影子相同，故稱之為投影法。投影法常用於觀察病毒和核酸分子等的形狀和大小，除可直接測出物體的長度和寬度外，尚可計算出其高度，如圖12-8。  圖12-8 金屬投影　　　　 h＝LtanQ　　　　　　　　　式中：h為被檢樣品的高度；L為影長；θ為投影角。　　 應用投影法要注意下麵幾點：　　(1)投影用金屬：對投影用金屬的要求是電子散射力強，粒子小，易蒸發，化學穩定，在電子束轟擊下不粒化。用於投影的金屬甚多，常用鉻、鉑、金、鉑鈀合金等。鉻易蒸發，但粒子大，約6nm。鉑密度大，化學穩定，電子轟擊下不粒化，粒子小，約25nm，但蒸發難。鉑鈀合金(3∶1～4∶1)易蒸發，粒子小，約25nm，但電子散射弱，在電子轟擊下易粒化。高倍放大的樣品一般應用鉑或鉑鈀合金投影；低倍放大的樣品，可用鉻投影。　　(2)投影角的選擇：投影角應根據樣品的大小選擇。核酸分子等線狀物或小型病毒用較小的角度，如tanθ＝1/10～1/15；大型病毒則可用較大些的投影角，tanθ＝1/5～1。　　(3)投影金屬量的確定：可先用不同量的金屬投影，找出合適的量。以後投影時，放置一定量的金屬，蒸發完為止。　　(4)真空度：真空度愈高愈好，一般需133322Pa(10-5　mmHg)。在較低真空度的條件下，金屬粒子易與氣體分子碰撞，落入陰影區後降低反差。　　投影法的優點是製成的樣品反差高，物像具有立體感。缺點是分辨力低。　　 2.複型　　如前述，在掃描電鏡應用之前，複型技術是唯一的能用透射電鏡觀察樣品表麵結構的製樣方法。自掃描電鏡問世後，雖然應用掃描電鏡能夠直接觀察樣品的結構，但是複型技術仍有它的獨到之處：①對於大塊不可分割的樣品或是不易作前處理或易受電子束損傷的樣品必須用複型法製備；②複型法製備的樣品可用透射電鏡觀察，其分辨率比掃描電鏡高。　　所謂複型，就是將樣品的表麵結構複製下來，為了增強樣品的反差，往往進行金屬投影，用透射電鏡觀察複型膜，圖像富有立體感。製樣方法簡便且不損傷樣品，其方法有以下幾種：　　　(1)一級複型 該法通常是用05～1％火棉膠醋酸戊酯或05％Formvar氯仿溶液滴在樣品上，待揮發後，在樣品表麵形成一層薄膜，然後將樣品放入蒸餾水中，通過水的浮力將薄膜與樣品分開或用化學試劑溶掉樣品，用蒸餾水清洗複型膜，將複型膜打撈在載網上，金屬投影和噴碳，電鏡觀察(圖12-9)。此複型的分辨率可達2～5nm，其缺點是剝離時容易變形且難與樣品分離。　  圖12-9 一級複型 　　(2)預投影一級複型 該法直接在樣品表麵上進行金屬投影和噴碳，形成碳複型膜，再用化學試劑溶掉樣品，複型膜經蒸餾水清淨後，將其打撈在載網上，電鏡觀察(12-11)。 　 圖12-10 預投影一級複型 　(3)二級複型 先用比較厚的有機材料製成樣品的一級複型，剝離後以此為模板，經金屬投影及噴碳後製成二級複型，再用有機溶劑溶掉一級複型，留下二級複型，此為負複型(圖12-11)。常用的是醋酸纖維素紙(AC紙)——碳複型法，該法是先清潔樣品表麵，然後滴上少量醋酸甲酯，將適宜大小的AC紙(厚度002～003mm)貼上去，樣品表麵結構就印在了AC紙上，再將AC紙印有樣品結構的麵朝上，進行金屬投影和噴碳，製成二級複型膜，用醋酸甲酯溶液溶掉AC紙，留下的複型膜用丙酮和蒸餾水多次清洗，將其打撈在載網上即可觀察。  圖12-11 二級複型 　　(4)擬複型和微粒複型法 該法常用於微粒材料研究。將顆粒材料製成懸浮液，用微量噴霧器噴到剛剝開的雲母片上，幹燥後進行金屬投影和噴碳，以斜方向將雲母片插入10％丙酮水溶液中，其複型膜就漂浮在液麵上，用載網打撈後就可進行電鏡觀察，將此稱為擬複型法。如果將微粒物質腐蝕掉，就得到該微粒的複型膜，故此稱為微粒複型法(圖12-12)。　　　　　　　　  圖12-12 微粒複型

 

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