中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準出口食品中產氣莢膜梭狀芽孢杆菌
SN0177-92檢驗方法 代替ZB X09 004-86Method for detection of clostridium perfringens in food for export1
1主題內容與適用範圍
本標準規定了出口食品中產氣莢膜梭狀芽孢杆菌的檢驗方法。
本標準適用於出口食品的檢驗。
2 設備和材料
2.1 吸管1.0mL和10.0mL，分別具有0.1mL和1.0mL刻度。
2.2 菌落計數器。
2.3 均質器。
2.4 厭氧培養裝置。
2.5 超低溫冰箱。
2.6 恒溫培養箱：36±1℃。
2.7 恒溫水浴箱：46±1℃。
2.8 培養皿：90或100mm。
2.9 顯微鏡。
3 培養基和試劑
3.1 胰(月示)-亞硫酸鹽-環絲氨酸(TSC)瓊脂。
3.2 D-環絲氨酸溶液。
3.3 卵黃乳液。
3.4 緩衝動力-硝酸鹽培養基。
3.5 乳糖-明膠培養基。
3.6 產芽孢肉湯。
3.7 多價蛋白腖-酵母膏(PY)培養基。
3.8 硫乙醇酸鹽液體培養基。
3.9 蛋白腖水。
3.10 亞硝酸鹽試劑。
3.11 緩衝甘油-氯化鈉溶液。
4 樣品製備
4.1 樣品的貯存和運送如不能立即進行檢驗時，應在樣品中加等量緩衝甘油-氯化鈉溶液(液體食品應加雙料的)。將樣品作低溫保存，直到檢驗。運送樣品時，應使樣品保持冷凍狀態，並要避免容器破損。
4.2 製樣
將樣品解凍，取25g移入滅菌均質杯，加225mL蛋白腖水，以13000r/min均質2min，如為液體樣品，則取樣25mL，加入盛有225mL稀釋劑的500mL稀釋瓶中，搖勻，吸取此1:10樣品勻液10 mL加於90mL蛋白腖水中，搖勻，製成1:100樣品稀釋液，必要時，按此法將樣品作進一步的10倍遞增稀釋，如從10**-3～10**-4……。
5 檢驗
5.1 平板計數法
傾注不含卵黃的TSC瓊脂到10個滅菌平皿中，每皿約5mL，並迅速旋轉平皿，使瓊脂鋪平。當瓊脂凝固後，將每個平皿編號標記，以無菌操作，吸取稀釋液樣品1 mL分別加到每個瓊脂平板表麵中心。再向平皿中傾注不含卵黃的TSC瓊脂15 mL，緩慢地旋轉平皿，使其與接種物混合均勻。
也可用滅菌L 形玻璃棒，將0.1mL樣品稀釋液均勻地塗布於含卵黃乳液的TSC瓊脂上，將平行板水平靜置5～10min，使接種物被吸收。然後用不含卵黃的TSC瓊脂10 mL覆蓋平板表層(含卵黃的TSC瓊脂最適於同時含有其他還原亞硫酸鹽梭狀芽孢杆菌的食品)。瓊脂凝固後，將平板正置於厭氧罐內，於36±1℃培養。不含卵黃的TSC瓊脂平板培養20 h，含卵黃的TSC瓊脂平板培養24h，取出平板，用肉眼觀察生長情況和有無黑色菌落。挑選生長有20～200個黑色菌落的平板，用菌落計數器將黑色菌落計數並計算每克食品中產氣莢膜梭狀芽孢杆菌數。產氣莢膜梭菌的菌落在含卵黃的培養基上呈黑色, 並通常有2～4mm寬的白色沉澱環(卵磷脂酶作用的結果)。但有少數菌株的卵磷脂酶反應較弱，或呈陰性。應對所有懷疑為產氣莢膜梭菌的黑色菌落數進行計數，並按5.2條加以證實。
5.2 證實
從可計數的平板(具20～200個菌落)中挑選10個典型菌落，分別接種到液體硫乙醇酸鹽培養基試管中，36±1℃培養18～24h。取培養物塗片，作革蘭氏染色，鏡檢，檢查培養物的純度和細菌形態。產氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性，粗短的梭狀芽孢杆菌。對於被汙染的培養物可劃線接種在含有卵黃的TSC瓊脂平板上，於厭氧條件下36±1℃培養24 h，以獲得純培養物。
用3mm接種環，取液體硫乙醇酸鈉純培養物，或從TSC瓊脂平板上分離到的單個菌落，穿刺接種緩衝動力-硝酸鹽和乳糖-明膠培養基。以1 mL液體硫乙醇酸鹽培養物接種到產芽孢肉湯中，36±1℃培養24 h。在透射光下檢查緩衝動力-硝酸鹽培養基試管中細菌沿穿刺線生長情況,有動力的菌株沿著穿刺線呈擴散生長。沒有動力的菌株,僅沿著穿刺線生長。 加0.5mL試劑甲和0.2 mL試劑乙於緩衝動力-硝酸鹽培養基中以檢查亞硝酸鹽的存在。於15min內出現橙色者，表明有亞硝酸鹽存在。如果不出現顏色變化，則加少許金屬鋅粉,放置10 min。如果加鋅粉後，不出現顏色變化，表明硝酸鹽已完全還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽又被分解成了氨和氮，如變為橙色，表明菌株不能還原硝酸鹽。
檢查乳糖-明膠培養基,如發現產氣和培養基由紅色變為黃色, 表明乳糖發酵並產酸。將試管置5℃冷卻1h，檢查明膠液化情況。如果培養基是固態，需36±1℃再培養24 h，重複檢查明膠是否液化。用產芽孢肉湯塗片作革蘭氏染色，在顯微鏡下檢查有無芽孢。如需對分離物作進一步檢查，應將芽孢培養物於4℃存放。
無動力、革蘭氏陽性，在TSC瓊脂平板上產生黑色菌落，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，乳糖發酵產酸產氣，在48 h內液化明膠的杆菌，可初步認為是產氣莢膜梭菌。可疑為產氣莢膜梭菌而又不符合上述特征的，必須做進一步證實試驗。對不液化明膠或在其他方麵不典型的分離物要接種液體硫乙醇酸鹽培養基，36±1℃培養24h，進行塗片，作革蘭氏染色，檢查培養物的純度，以0.1 mL液體硫乙醇酸鹽培養物，接種到含1％水楊甙和含1％棉子糖的PY培養基各1 管，觀察產酸和產氣，取1.0 mL培養物放於試管中，加1～2滴0.04％酚紅溶液，檢查是否產酸(大多數產氣莢膜梭菌，不發酵水楊甙，但同它密切相關的梭狀芽孢菌，能迅速發酵水楊甙產酸產氣)。再將此兩種培養基培養48h，觀察產酸情況。產氣莢膜梭菌通常在含棉子糖的培養基中產酸，而同其密切相關的其他梭狀芽孢菌卻不能在含棉子糖的培養基中產酸。有少數產氣莢膜梭菌菌株，在含水楊甙的PY培養基中產酸。6 結果解釋及報告
樣品中產氣莢膜梭菌的計數, 基於被證實為產氣莢膜梭菌菌落的百分數(例如,10(-4)稀釋的平板中，平均有85個菌落，10個菌落中，有8 個被證實為產氣莢膜梭菌，那麽每克食品中產氣莢膜梭菌數，即為85×(8/10)×10000＝680000)，報告產氣莢膜梭狀芽孢杆菌數/g(mL)。
注：用含卵黃的TSC平板計數時的稀釋倍數比用不含卵黃的平板計數時的稀釋倍數高10倍。
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