GBT 4789.8-2016小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗

1 範圍
本標準規定了食品中小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)的檢驗方法。
本標準適用於食品中小腸結腸炎耶爾森氏菌的檢驗。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
2.1 冰箱:0℃~4℃。

2.2 恒溫培養箱:26℃±1℃、36℃±1℃。
2.3 顯微鏡:10倍~100倍。
2.4 均質器。
2.5 天平:感量0.1g。
2.6 滅菌試管:16mm×160mm、15mm×100mm。

2.7 滅菌吸管:1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。
2.8 錐形瓶:200mL、500mL。
2.9 滅菌平皿:直徑90mm。

2.10 微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定係統。
3 培養基和試劑
3.1 改良磷酸鹽緩衝液:見A.1。

3.2 CIN-1培養基(CepulodinIrgasanNovobiocinAgar):見A.2。
3.3 改良Y培養基(AgarY,Modified):見A.3。
3.4 改良克氏雙糖培養基:見A.4。
3.5 糖發酵管:見A.5。
3.6 鳥氨酸脫羧酶試驗培養基:見A.6。

3.7 半固體瓊脂:見A.7。
3.8 緩衝葡萄糖蛋白腖水[甲基紅(MR)和V-P試驗用]:見A.8。
3.9 堿處理液:見A.9。
3.10 尿素培養基:見A.10。

3.11 營養瓊脂:見A.11。
3.12 小腸結腸炎耶爾森氏菌診斷血清。
4 檢驗程序

小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗程序見圖1。

5 操作步驟
5.1 增菌
以無菌操作取25g(或25mL)樣品放入含有225mL改良磷酸鹽緩衝液增菌液的無菌均質杯或均質袋內,以8000r/min均質1min或拍擊式均質器均質1min。液體樣品或粉末狀樣品,應振蕩混勻。均質後於26℃±1℃增菌48h~72h。增菌時間長短可根據對樣品汙染程度的估計來確定。
5.2 堿處理
除乳與乳製品外,其他食品的增菌液0.5mL與堿處理液4.5mL充分混合15s。
5.3 分離
將乳與乳製品增菌液或經過堿處理的其他食品增菌液分別接種於CIN-1瓊脂平板和改良Y 瓊脂平板,26℃±1℃培養48h±2h。典型菌落在CIN-1上為深紅色中心,周圍具有無色透明圈(紅色牛眼狀菌落),菌落大小為1mm~2mm,在改良Y瓊脂平板上為無色透明、不黏稠的菌落。
5.4 改良克氏雙糖試驗
分別挑取5.3中的可疑菌落3個~5個,分別接種於改良克氏雙糖鐵瓊脂,接種時先在斜麵劃線,再於底層穿刺,26℃±1℃培養24h,將斜麵和底部皆變黃且不產氣的培養物做進一步的生化鑒定。
5.5 尿素酶試驗和動力觀察
用接種環挑取一滿環5.4得到的可疑培養物,接種到尿素培養基中,接種量應足夠大,振搖幾秒鍾,26℃±1℃培養2h~4h。將尿素酶試驗陽性菌落分別接種於兩管半固體培養基中,於26℃±1℃和36℃±1℃培養24h。將在26℃有動力而36℃無動力的可疑菌培養物劃線接種營養瓊脂平板,進行純化培養,用純化物進行革蘭氏染色鏡檢和生化試驗。
5.6 革蘭氏染色鏡檢
將純化的可疑菌進行革蘭染色。小腸結腸炎耶爾森氏菌呈革蘭氏陰性球杆菌,有時呈橢圓或杆狀,大小為(0.8μm~3.0μm)×0.8μm
5.7 生化鑒定
5.7.1 從5.5中的營養瓊脂平板上挑取單個菌落接種生化反應管,生化反應在26℃±1℃進行。小腸結腸炎耶爾森氏菌的主要生化特征以及與其他相似菌的區別見表1。

5.7.2 如選擇微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定係統,可根據5.6鏡檢結果,選擇革蘭陰性球杆菌菌落作為可疑菌落,從5.5所接種的營養瓊脂平板上挑取單菌落,使用微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定係統進行鑒定。
5.8 血清型鑒定(選做項目)
除進行生化鑒定外,可選擇做血清型鑒定。在潔淨的載玻片上加一滴O 因子血清,將待試培養物混入其內,使成為均一性混濁懸液,將玻片輕輕搖動0.5min~1min,在黑色背景下觀察反應。如在2min內出現比較明顯的小顆粒狀凝集者,即為陽性反應,反之則為陰性,另用生理鹽水作對照試驗,以檢查有無自凝現象;具體操作方法可按GB4789.4中沙門氏菌O 因子血清分型方法進行。
6 結果與報告
綜合以上及生化特征報告結果,報告25g(或25mL)樣品中檢出或未檢出小腸結腸炎耶爾森氏菌。

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