［摘 要］ 目的：探討結核分枝杆菌耐鏈黴素(SM)和利福平(RFP)的耐藥分子機製，應用聚合酶鏈反應一單鏈構象多態性(PCRSSCP)同時檢測rpsL基因、rpoB基因突變在結核分枝杆菌耐SM和RFP耐藥性測定中的應用價值。方法：采用PCRSSCP技術對168株結核分枝杆菌臨床分離株rpsL基因、rpoB基因突變同時進行檢測。即首先用PCR方法同時擴增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因，然後進行SSCP分析。結果：以結核分枝杆菌H37RV為對照，82株藥物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未見SSCP圖譜異常。特異性為100％。86株同時耐SM和RFP的耐藥株中，68株(79．1％)有rpsL基因圖譜異常；81株(94．2％)有rpoB基因圖譜異常。結論:rpoB基因突變和rpsL基因突變分別是結核分枝杆菌耐RFP和SM的主要分子機製。應用PCRSSCP技術可同時快速檢測結核分枝杆菌SM和RFP耐藥性。 本文來自檢驗地帶網
［關鍵詞］ 結核分枝杆菌；藥物耐受性；鏈黴素；利福平；rpsL基因；rpoB基因
Abstract：Objective To study on the molecular mechanisms of rifampin and streptomycinresistant Mycobacterium tuberculosis.Detection rpoB and rpsL gene mutations in rifampin and streptomycinresistant Mycobacterium tuberculosis using Polymorphism(PCRSSCP).Methods 168 clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis of rpoB and rpsL genes were detected using PCRSSCP.Results Strain H37RV was used as control, SSCP pattern of rpoB,rpsL PCR amplification from 82 drug susceptible strains were all the same as control.The specificity was 100%.SSCP pattern of rpsL gene were different from control in 68 drug resistant clinical isolates.SSCP pattern of rpoB gene were different from control in 86 drug resistant clinical isolates.The sensitivity were 79.1%(rpsL),94.2%(rpoB),respectively.Conclusions The results confirm that mutations of rpsL and rpoB genes are the most important mechanisns in streptomycin and rifampin resistant tuberculosis, respectively. www.labdd.com
Key words:Mycobacterium tuberculosis；Drug resistance；Streptomycin；Rifampin； RpsL gene；rpoB gene
利福平(RFP)、鏈黴素(SM)是結核病治療中最重要的兩種一線抗結核藥物，其耐藥情況日益嚴重。而傳統的結核分枝杆菌耐藥性測定由於耐藥結核分枝杆菌生長極為緩慢，需6周~8周甚至更長時間，不能及時指導臨床用藥。近年來在耐藥性快速測定方麵取得了一些進展［1］。有文獻報道［2］結核分枝杆菌耐SM的產生與其核糖體蛋白S12編碼基因rpsL基因突變有關。而RFP耐藥則與RNA聚合酶的β亞基的編碼基因rpoB突變有關。因此，建立一種新的快速、有效的藥敏試驗方法對結核病的早期治療具有重要的意義。我們在用PCRSSCP方法單獨檢測rpsL和rpoB基因突變時，發現在非變性聚丙烯酰胺凝膠中，這兩種基因的遷移率不同，且位置不重疊，差異很大。因此，我們在一個反應中同時擴增rpsL基因和rpoB基因。在根據其SSCP圖譜進行分析，這樣就可以同時檢測SM和RFP耐藥性，大大節省了時間和材料。現將結果報告如下。
1 材料和方法
1．1 菌種來源 結核分枝杆菌H37RV標準株來源於中國藥品生物製品檢定所。82株藥物敏感株和86株同時對SM和RFP耐藥株來自解放軍三零九醫院和本院結核科。按結核病診斷細菌學規程進行菌種鑒定及藥物敏感性試驗，耐藥株同時對SM和RFP耐藥。受試臨床分離株均鑒定為結核分枝杆菌。
1.2 細菌DNA提取 結核分枝杆菌H37RV標準株、結核分枝杆菌臨床分離株在LJ雞卵培養基上37 ℃培養4周，分別刮取菌落研磨，以TE液懸浮。破壁采用經典的酶解法，用常規酚/氯仿提取。
1．3 引物 分別由上海塵工和中科院微生物所合成。序列為rpsL15’AGTAAGGTCAAGACCGCGrpsL25’CTGCGTATCCAGCGAACC擴增片段長度267bp。rpoB１5’CGGATGACCACCCAGGACrpoB25’GGTTTCGATCGGGCACAT擴增片段長度258bp。PCR反應體係：采用25 μl反應體係，4×dNTPS終濃度為0．3 mmol/L，比較了rpsL和rpoB不同引物濃度對PCR擴增的影響。擴增程序為95 ℃預變性10 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個循環，最後一個循環72 ℃保溫7 min，擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測出現267bp和258bp兩條帶。
1．4 SSCP銀染 取擴增產物5 μl~10 μl，加入等量甲酰胺變性液，煮沸變性10 min，立即冰浴5 min後，在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。條件為6 ℃、100 V電壓，電泳約2 h~3 h，電泳結束後，取凝膠板行硝酸銀染色，觀察結果並照像。
2 結果
2．1 PCR擴增時引物選擇 實驗證明rspL基因引物終濃度為0．1 μmol/L，rpoB基因引物終濃度為0．3 μmol/L時，擴增條帶清晰,產量基本一致，擴增效果好。
2．2 SSCP結果 168株結核分枝杆菌臨床分離株中，82株藥物敏感株SSCP同標準株H37RV圖譜相同，無突變檢出。86株同時耐SM和RFP分離株中，有68株有rspL基因發生突變，突變率為79．1％。同時有81株有rpoB基因發生突變，突變率為94．2％。結果見表1。
表1 SM和RFP耐藥與rspL和rpoB基因突變結果常規藥敏試驗 （略）
注：a耐藥株SSCP圖譜與敏感株有差異
3 討論
PCRSSCP是一種快速，準確的耐藥分析方法。以往的報道均為單基因PCRSSCP［4］。近年來雖然也出現了一些新的結核病耐藥性檢測方法［3］線性探針如DNA序列分析、生物芯片等，但都有各自的局限性。或價格昂貴，或步驟繁瑣，不適於推廣。我們采用雙基因PCR擴增後，再進行SSCP分析，結果表明，同時耐SM和RFP臨床分離株rpsL基因突變率為79．1％，rpoB基因的突變率為94．2％，敏感株均無突變，特異性為100％，這與國內外報道相似［5，6］。表明rpsL基因突變、rlpoB基因突變是結核分枝杆菌耐SM和RFP耐藥的主要分子機製之一。影響PCRSSCP的因素很多。由於rpoB基因是單挎貝，其PCR擴增的敏感性較低，且為屬特異性，因此，我們在進行PCR擴增時，加大了rpoB擴增的引物量，並同時相應增加了4×dNTPS的量，選擇了最適的擴增條件。在PCR擴增時由於兩種引物相互競爭，擴增的條帶可能以一條為主，而另一條淡或不甚清晰，但由於SSCP銀染的敏感性很高，所以並不影響結果的判讀。因此，對於同時進行兩種基因的SSCP檢測時，PCR擴增條件的選擇顯得非常重要。在進行SSCP時，由於rpoB和rspL基因擴增的產量可能有所不同：因此在顯色時注意觀察以H37RV對照的條帶清晰為主，兼顧待測菌株的顯色情況，適時終止反應。我們采用雙基因擴增PCRSSCP技術同時對結核分枝杆菌臨床分離株的SM、RFP耐藥性進行檢測使應用傳統藥敏法需時1個月~2個月縮短到2 d即可完成。並同時使SM和RFP耐藥株得以同時檢出，大大縮短了檢測時間，適於臨床的推廣應用。
參考文獻：
[1] Marttuke G J,Soini H,Vyhneueskiy B,et al.Rapid detection of rifampinresistant.Mycobacterium tuberculosis by sequencing and line probe assay［Ｊ］.Scand J Infect Dis, 1998，30(2):129132.
[2] Gingeras TR,Ghandour G,Wang E,et al.Simultaneous genotyping and species identufication using hybrdization pattern recopnition analysis of genetic mycobacterium DNA arrays［Ｊ］.Genome Res,1998，8(9)：84358448.
[3] 張小剛，何秀雲，陳紅兵，等.結核分枝杆菌耐藥分子機製的檢測技術的研究［J］.中國現代醫學雜誌，2003，13(10):2931.
[4] Williams D,Wagues Pack C,Eisenack K,et al.Characterization of rifampin in pathogenic Mycobacteria［Ｊ］.Antimicrob Agents Chemother,1994,38:23802386.
[5] 莊玉輝，何秀雲，張小剛，等.利福平結核分枝杆菌耐藥分子機製的研究［J］.中華結核和呼吸雜誌，2000，23(10):711714.
[6] Wison TM,Collins DM.ahpc,a gene involved in isoniazid resistance of the Mycobacterium Complex［Ｊ］.Mol Microbiol,1996,19:1025.
上一篇：細菌形態學的基本檢查方法
下一篇：自身免疫病病人革蘭陽性球菌感染分布及耐藥性
