醫學真菌檢驗（上）

醫學真菌學檢查是診斷真菌病的重要依據，隨著真菌感染病例的日益增多，對實驗室的診斷也提出了更高的要求。不論是患者淺部或深部感染診斷，幾乎全依賴於臨床標本的真菌學檢查。特別是係統性真菌感染，其早期特異的診斷方法是挽救患者生命的關鍵，而病原真菌的形態結構十分多樣，在不同條件下同一真菌也可有不同特點的形態。因此，在真菌的實驗室檢查中，必須熟練掌握各類真菌的形態特征以及在不同條件下的演變規律，才能獲得對致病真菌正確的診斷。目前真菌感染的實驗室檢查方法主要包括常規檢查法和特殊檢查法兩類。常規檢查法主要包括：①形態學檢查（直接鏡檢+染色鏡檢）。②培養檢查。③組織病理學檢查。特殊檢查主要包括：①血清學方法。②分子生物學方法。

一、進行真菌實驗室診斷的注意事項 
      ①應有獨立實驗室，不應與其他細菌、病毒等實驗室共用，以防發生相互汙染。②在每天工作前與工作後，工作台均要以消毒水例如5%石碳酸或0.5%過氧乙酸擦拭，如遇操作台被真菌或標本汙染，應即覆蓋紙巾，並用5%石碳酸消毒20min，切忌工作台汙染後即用水衝洗，以免汙染擴散。③培養菌檢體及真菌汙染的物質在丟棄前，必須高壓滅菌或焚燒。④在進行真菌檢查時，不可試著聞平板培養基特殊的氣味。⑤不可對Histoplasma capsulatum 以及 Coccidioides immitis進行載玻片培養技術，因為其等具有高度感染性的孢子能夠隨著空氣傳播。⑥實驗室禁止任意養花、草、動物等生物，以防實驗汙染。⑦工作環境應定期消毒。一般紫外線照射不能殺滅真菌，應用40%甲醛（可於每4㎡空間用35ml 40%甲醛加18g高錳酸鉀在密閉情況下熏蒸24h，或用環氧乙烷進行消毒，每2～4周消毒1次。⑧如果用平板培養基接種標本，必須將平板培養基密封，以免發生危險，在不常做真菌檢測的實驗室，最安全的培養方法是利用含有棉花塞的試管培養基（使空氣能夠循環）。⑨美國梅育診所主張利用平板培養基進行真菌的分離，步驟如下:平板培養基必須在生物安全箱內操作及檢查。平板培養必須用膠帶封好，平板培養基必須含30ml的量，並保持培養箱60%以上的濕度，同時增加瓊脂的濃度至2%，以免脫水。⑩真菌的診斷，需要經驗的累積及備有良好的圖譜參考書。

 

二、分離及鑒定真菌的培養基

（一）   配製培養基的一般原則

①各成分混勻後以文火緩慢加熱，並不斷攪拌，煮沸1min，過熱會破壞有效成分。②分裝試管應在高壓滅菌前，而分裝平皿應在高壓滅菌後。③高壓滅菌一般在118～121磅,10～15min。④需加血液或不能高壓的成分如抗生素，應在培養基冷卻至50 左右時加入混勻。⑤試管分裝量約7~8ml，平皿約15ml,如需培養4～6周，平皿內應有35～40ml的量。培養基中抗生素的濃度和添加方法：氯黴素、慶大黴素和放線菌酮能耐熱，可在培養基高壓滅菌前加入，其他抗生素均在培養基高壓滅菌後冷卻至45℃～50℃時加入。青黴素20～100μg/ml，鏈黴素40～200μg/ml，氯黴素50μg/ml，放線菌酮500μg/ml，慶大黴素5μg/ml。

 

（二）   分離和鑒定真菌的培養基

各種醫學真菌所用培養基的成分，又可根據不同要求，分成分離、富集、選擇、特性研究等含不同成分培養基，具體見表。

表  分離鑒定真菌培養基分類表

培養基種類 分離用培養基                                    使用目的
1.Brain heart infusion agar                                分離腐生性及病原性真菌
2.Brain heart infusion agar with antibiotics           分離除了皮膚絲狀真菌以外的真菌
3.Brain heart infusion biphasic blood 
Culture bottles                                                從血液中分離真菌
4.Dermatophyte test medium                               分離皮膚絲狀菌，建議僅做篩檢用
5.Inhibitory mold agar                                      分離除了皮膚絲狀真菌以外的真菌
6.Mycosel or mycobiotic agar                             分離皮膚絲狀菌
7.Ssbouraud dextrose agar                                 分離腐生性及病原性真菌
8.Yeast estract phosphate agar                            分離除了皮膚絲狀真菌以外的真菌
區分試驗培養基
1.Ascospore agar                                             檢測產子囊孢子酵母菌
2.Cornmeal agar with Tween 80 and trypan blue     檢測產厚膜孢子酵母菌
3.Cottonseed conversion agar                            使雙相型真菌由黴菌型轉變為酵母型
4.Czapek’s agar                                            分離及區分Aspergillus spp
5.Niger seed agar                                            鑒定Cryptococcus neoformans
6.Nitrate reduction medium                               檢測Cryptococcus spp.還原nitrate能力
7.Potato dextrose agar 證實Trichophyton rubrumm   產色素能力製作載玻片培養技術
8.Yeast fermentation broth                                 測定酵母菌的發酵能力
9.Yeast nitrogen base agar                                 測定酵母菌的糖類同化能力

 

三、臨床樣本的采集與處理

（一）   皮屑  邊緣、皰壁、膿液、深層趾（指）間皮屑或活動邊緣皮屑，取材前75%酒精消毒，作KOH塗片，同時種於沙氏瓊脂加氯黴素2管，置25℃培養2周。

（二）   甲屑  用細挫或牙科磨鑽取病甲與正常甲交界處並且貼近甲床部的甲屑，標本用酒精浸泡待幹燥後種於沙氏（SDA）培養4周，並同時作KOH塗片。

（三）   毛發  取病發（變色，無光澤，彎曲，脆易折斷，鬆動易拔除）15根，75%酒精消毒，3～5根作直接鏡檢，5～10根種於沙氏瓊脂（加氯黴素），劃破斜麵掩埋。

（四）   （四）膿液  無菌采集，注意顆粒，用無菌蒸餾水稀釋後尋找。可作G染色或抗酸染色，常規的KOH塗片及SDA接種培養也是必要的。

（五）   CSF  采集於無菌試管3～5ml，立即送檢。置冰箱不宜超過1h。離心後以無菌吸管吸取離心沉澱物1ml，作墨汁塗片鏡檢和培養（SDA）25℃或37℃4周。

（六）   血液  無菌抽血3～5ml立即於無菌抗凝管中，BHIB:血標本量為培養基量的1/10，37℃5～7d出現渾濁或菌團，挑取鏡檢同時移種SDA（注：每天檢查完畢後需搖動培養基，37℃震蕩培養可加速真菌的生長，提高檢出率。不作直接檢查，因其直接檢查陽性率低。

（七）   體液、痰液、尿液、糞便  ①體液標本量10ml離心沉澱取2ml沉澱液做直接鏡檢培養。②晨痰3～5ml集於無菌瓶中(無菌生理鹽水漱口數次後)，挑取黏液或膿性部分：KOH塗片培養。③早晨中段尿或清潔尿10ml，離心取沉澱液1ml做KOH塗片培養（SDA每管種0.5ml）。④拭子：一般盡量不用，缺點：A.不能得到足量的標本；B.采集的標本也不易從棉花纖維上分離下來;C.容易幹竭。采集標本後應迅速放入內裝1~2ml無菌蒸餾水的試管送檢KOH塗片培養。⑤紙盒送檢，挑取黏液、膿血、乳酪樣部分KOH塗片培養（加抗生素）注：單純培養陽性，不一定有臨床意義，KOH塗片發現菌絲，有診斷意義。

（八）   組織：標本置無菌平皿中立即送檢，置無菌勻漿器加2ml蒸餾水，研磨成漿或1～2mm3的小塊，KOH塗片培養。