博檢革蘭氏陰性細菌鑒定係統原理及使用方法

一、產品介紹：
  本係統由青島高科園betway必威西汉姆联生物技術有限公司聯合山東省出入境檢驗檢疫局共同研發設計，篩選21項生化反應，曆經兩年多的不斷改良，現可鑒定一百多種常見革蘭氏陰性細菌，鑒定結果接近100%，可廣泛用於革蘭氏陰性細菌的快速鑒定。

二、使用方法：
  1、挑取新培養的待檢測菌單菌落於9mL生理鹽水中製成菌懸液，用酒精棉擦拭打孔器和蓋子消毒，將生化鑒定條打孔後，每孔接種100μL菌液，氨基酸需覆蓋約300μL無菌石蠟，蓋上蓋子至於37℃培養24h後，觀察實驗結果。
  2、滴加1-2滴無菌水將氧化酶試紙潤濕，使用玻璃棒挑去新鮮菌落塗抹於氧化酶試紙，觀察試驗結果。
  3、每三孔記為1組，共7組（氧化酶為最後一位），第一孔若陽性記為1，第二孔若陽性記為2，第三孔若陽性記為4，若為陰性則記為0，將每組三孔數值相加，便可得到7個數組成的編碼，將此編碼輸入數據庫（如有反應不確定可在前麵打對號），讀取鑒定結果。

三、原理及結果判斷：
  不同種屬的細菌具有不完全相同的生化特征。本係統選取21種典型生化試驗（20孔生化鑒定條和一個氧化酶試紙），並把生化反應的結果轉換為一個8進製數，通過提供的標準數據庫查詢係統可得到實驗菌株歸屬的相對概率、T值和R值，對菌株的歸屬進行一定程度的鑒定。
  1孔為ONPG試驗，有些細菌有β-半乳糖苷酶，可水解ONPG，釋放出黃色的鄰位硝基苯酚，因此溶液變黃為陽性反應，無色為陰性反應。
  注意事項：ONPG反應較快，接種菌量大時數小時即可獲得陽性結果，該試驗亦可鑒別遲緩發酵乳糖和不發酵乳糖細菌，如宋內誌賀氏菌遲緩發酵乳糖變黃，ONPG可24h內陽性。

乳糖發酵管	ONPG

  2、3、4孔分別為精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶試驗，有些細菌可產生某種氨基酸脫羧酶，使該種氨基酸脫去羧基生成胺，使培養基呈堿性，此反應需在厭氧、酸性環境中進行，培養基中含有葡萄糖，前期細菌發酵葡萄糖產酸，繼續培養時，氨基酸脫羧產胺使培養基變堿，溴甲酚紫為酸堿指示劑，因此溶液呈紫色為陽性反應，黃色為陰性反應。
  注意事項：

  ①由於有些菌分解腖類產堿較快，出現灰紫色或灰白色（如肺炎克雷伯氏菌在鳥氨酸中培養18h時為黃色，24h變為灰白色），判定為陰性；

  ②培養時間不宜超過24h，有些菌分解腖類產堿較多會導致24h後陰性反應變為紫色，形成假陽性，如產氣腸杆菌和陰溝腸杆菌等。

  ③觀察結果前需注意試驗管是否混濁長菌，若未長菌則需重新接種試驗，除少數專性需氧菌如銅綠假單胞菌等。 

  5孔為檸檬酸鹽利用試驗，有些細菌可利用銨鹽作為唯一氮源，並同時利用檸檬酸鹽作為唯一碳源提供能量進行生長繁殖，分解檸檬酸鹽產生碳酸鹽和碳酸氫鹽，銨鹽被分解產生氨，使培養基變堿性，酚紅為酸堿指示劑，溶液變紅為陽性，未生長顏色不變為陰性；
  注意事項：利用檸檬酸鹽陰性菌在此培養基上不生長，有些陽性菌如有些沙門氏菌在此培養基上生長較慢，若觀察到培養基渾濁但未變紅可繼續培養至變紅仍可記為陽性。
  6孔為硫化氫試驗，有些細菌可分解蛋白腖中的胱氨酸或還原培養基中的硫酸鹽產生硫化氫，與硫酸亞鐵反應生成黑色的硫化鐵，因此培養基變黑為陽性反應，不變黑為陰性反應。
  7孔為脲酶試驗，有些細菌可產生尿素酶，分解尿素後產生大量氨，使培養基呈堿性，酚紅為酸堿指示劑，因此培養基變紅為陽性，變黃或顏色不變為陰性。
  注意事項：由於大量產氨陽性反應為很明顯的紅色，若24h為陰性，應每天觀察結果至7天，7天後不變紅為陰性。

  8孔及12-20孔為糖醇類發酵試驗，若細菌能發酵利用某種糖或醇，則會產酸使培養基pH下降，溴麝香草酚藍為酸堿指示劑，因此溶液變黃為陽性，顏色不變或變藍為陰性；(下圖以棉子糖為例）

  注意事項：

  ①有些菌像阪崎腸杆菌、肺炎克雷伯菌等利用糖產酸較快，且繼續生長產堿也較快。所以觀察結果需較早，從18h開始觀察，變黃則記為陽性；最好每隔一段時間觀察一次直至48h，期間若變黃則記為陽性。

  ②有些菌發酵糖類為弱陽性可能出現淺綠色、黃綠色等不好判斷的結果，可在係統中勾選此項反應。

  ③有些菌為遲緩發酵型，很難在博檢條孔中產酸，需根據判定結果調整或補做試驗。

  9孔為吲哚試驗，有些細菌可分解色氨酸形成吲哚，加入二甲基苯甲醛（靛基質試劑盒）後反應生成玫瑰紅色吲哚環，則為陽性反應，加入試劑後若顏色不變，則為陰性反應；

  10孔為V-P試驗，有些細菌分解葡萄糖過程中會產生乙酰甲基甲醇，在堿性溶液中乙酰甲基甲醇被氧化後可與胍基反應生成紅色化合物，因此加入VP試劑（V-P試劑盒）後變紅為陽性反應，顏色不變或棕黃色為陰性反應；

  注意事項：建議培養24-48h，滴加V-P試劑後輕輕混勻，陽性反應可立刻或於數分鍾內出現紅色，如為陰性，應放在36℃±1 ℃繼續培養0.5-4 h 再進行觀察。

  11孔為明膠分解試驗，明膠溶液在低溫下呈固態，某些細菌可將明膠水解為多肽和氨基酸，使明膠失去凝膠性質，因此最終明膠不凝固為陽性，凝固為陰性；（下圖所示為明膠陽性與陰性對照）

  注意事項：有些菌水解明膠較慢，所以必要時需延長培養3-7天。

  氧化酶試紙：某些細菌具有氧化酶，可氧化四甲基對苯二胺生成紅色的醌類氧化物，因此試紙呈現藍色至藍紫色為陽性，顏色不變為陰性。（下圖為氧化酶陽性實驗結果）

  注意事項：挑取菌落時不能用鎳鉻絲等金屬製品，以防產生假陽性結果。

四、使用方法：

  1、挑取新培養的待檢測菌單菌落於9mL生理鹽水中製成菌懸液，用酒精棉擦拭打孔器和蓋子消毒，將生化鑒定條打孔後，每孔接種100μL菌液，氨基酸需覆蓋約300μL無菌石蠟，蓋上蓋子至於37℃培養18-24h後，觀察實驗結果。

  2、滴加1-2滴無菌水將氧化酶試紙潤濕，使用玻璃棒挑去新鮮菌落塗抹於氧化酶試紙，觀察試驗結果。

  3、每三孔記為1組，共7組（氧化酶為最後一位），第一孔若陽性記為1，第二孔若陽性記為2，第三孔若陽性記為4，若為陰性則記為0，將每組三孔數值相加，便可得到7個數組成的編碼，將此編碼輸入數據庫（如有反應不確定可在前麵打對號），讀取鑒定結果。

五、實驗舉例：

  現選取常見17株革蘭氏陰性細菌進行試驗，試驗及鑒定結果如下：

  1、沙門氏菌

  沙門氏菌ATCC14028的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  

  2、甲型副傷寒沙門氏菌

  甲型副傷寒沙門氏菌CMCC50093的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  3、大腸埃希氏菌

  大腸埃希氏菌ATCC25922的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  4、奇異變形杆菌

  奇異變形杆菌CMCC49005的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  5、普通變形杆菌

  普通變形杆菌ATCC13315的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  6、陰溝腸杆菌

  陰溝腸杆菌ATCC23355的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  7、產氣腸杆菌

  產氣腸杆菌CMCC45103的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  8、弗氏檸檬酸杆菌

  弗氏檸檬酸杆菌ATCC43864的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  9、產酸克雷伯氏菌

  產酸克雷伯氏菌CICC22913的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  10、粘質沙雷氏菌

  粘質沙雷氏菌ATCC13880的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  11、福氏誌賀氏菌

  福氏誌賀氏菌ATCC12022的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  12、宋內誌賀氏菌

  宋內誌賀氏菌ATCC25931的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  13、小腸耶爾森氏菌

  小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC52004的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  14、副溶血性弧菌

  副溶血性弧菌ATCC17802的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  15、霍亂弧菌

  霍亂弧菌非O1的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：   

  16、創傷弧菌

  創傷弧菌ATCC27562的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  17、溶藻弧菌

  溶藻弧菌ATCC33787的試驗結果如下圖所示：

  係統鑒定結果如下圖所示：

  綜上所述，博檢革蘭氏陰性細菌鑒定係統適用範圍廣、準確率高，是革蘭氏陰性細菌鑒定的極佳選擇。

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