發酵罐中補料分批發酵研究

一．實驗目的

加深對培養方法的認識，了解補料分批續培養過程控製方法。

二．實驗原理

補料分批培養，是一種介於分批培養和連續培養之間的過渡培養方式，是在分批培養的過程中，間隙或連續地補加新鮮培養基的培養方法。流加培養同時兼有間歇培養和連續培養的某些特點，其優點是，可使發酵係統中維持很低的底物濃度，減少底物的抑製或其分解代謝物的阻遏作用，不會出現當某種培養基成分的濃度高時影響菌體得率和代謝產物生成速率的現象。

三．菌種與培養基

1.啤酒酵母

2．培養基(g/L)

葡萄糖20，酵母浸粉 5.0，KH₂PO₄ 3.0，Na₂HP0₄ 1.0，MgSO₄  1.0，pH 5.0。流加的濃葡萄糖液質量濃度為25 g／100 ml。保持培養基中糖的質量濃度在0.5 g/L，流加液的糖的質量濃度為25—30 g/100 m1。

四．實驗方法

1．流加培養前的準備工作 

在培養罐中加入去離子水，將溫度傳感器、除菌過濾器安裝好，用矽橡膠管連接好取樣口、流加液入口，不需要的接口全部封好。橡膠管用彈簧夾夾住，排氣口用一小段棉花塞好。確認所有連接沒有問題後，打開通風排氣係統，檢查是否有漏氣、阻塞現象(輕輕堵住排氣口，看其他地方是否漏氣)，確認正常。

2.種子培養

自斜麵菌種挑起一環啤酒酵母菌體。接入裝有50ml 培養基的250 ml三角瓶中，搖勻後，置於24℃培養箱培養36 h。將上述培養好的液體種子接入用250ml三角瓶裝的滅過菌的100ml液體培養基中，接種量10％，在24℃下培養36h。

3．流加培養   

培養罐中加入已調配好的培養基後，放在滅菌鍋中滅菌121℃，20－30 min，葡葡糖和消泡劑分別同時滅菌。培養罐取出後，開通冷卻水進行冷卻，同時開動攪拌器，通入無菌壓縮空氣以防產生負壓,冷卻到發酵溫度25 ℃。利用矽皮管將25 g/100m1葡萄糖液貯瓶和0.1 mol/L氨液貯瓶分別連接蠕動泵和培養罐上的入口，再將兩個貯瓶上的排氣口塞上棉花用彈簧夾夾住。消泡劑貯瓶排氣口塞上錦花。如果傳感器不能用蒸汽加壓滅菌，可以在室溫下把傳感錫在75％酒精中浸泡加進行滅菌，然後用無菌水洗淨，盡快安裝在培養罐上。通氣量在3—5 L/min，攪拌轉數在200～600rpm接種量10％。開動蠕動泵流加25g/100mL葡萄糖，使發酵罐內葡萄糖濃度達到20～30g/L，滴加0.1 mol/L氨液，控製培養掖pH為5.0。通過調節風量和攪拌轉數控製溶氧濃度在10％左右。流加培養7—10h，每隔0.5-1h取樣測定培養液中葡萄糖濃度、菌體量和副產物乙醇濃度。取樣口經常用75％的酒精浸泡以保持清潔。培養結束後，將培養液進行蒸汽加壓滅菌棄去。清洗培養罐。在發酵過程中消泡劑應盡量少加。

四．分析方法

1．菌體量(X) 生物量的測定

生物量的測定方法有比濁法和直接稱重法等。本實驗采用比濁法。以空白培養基為對照，在550 nm處測定發酵液的吸光值。

五．實驗結果

（1）畫出培養液中酵母菌體量(g/L)隨流加培養時間的變化曲線。

（2）計算酵母細胞的產率(質量分數，葡萄糖)。

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