發根農杆菌對植物的Ri質粒轉化與表達(二)

本實驗正是通過A₄發根農杆菌的介導，對煙草、油菜、甘藍等植物進行基因的改造，得到它們的發狀根。

1菌種：發根農杆菌A4 （抗利福黴素）

2器材：超淨工作台、高壓蒸汽滅菌鍋、光照培養箱、恒溫震蕩搖床、pH酸度計、電子天平、培養皿（6-9cm）若幹套、1000ml燒杯2隻、容量瓶（10、50、100、500、1000ml）各1隻，三角瓶（100ml）20隻，玻璃棒若幹隻，酒精燈一隻，鋁箔、稱量紙、長剪刀、解剖刀、長鑷子、接種針、移液槍（10、200、1000μl）各1隻

 

3藥品：

配製MS植物基本培養基藥品：NH₄NO₃ 、KNO₃ 、CaCl₂ 、MgSO₄7H₂O、 KH₂PO 、KI、H₃BO₃ 、MnSO₄.7H₂O、 ZnSO₄.2H₂O、Na₂MoO₄.2H₂O、 CuSO₄.5H₂O、CoCl₂.6H₂O、CoSO₄.7H₂O、 FeSO₄.7H₂O、Na₂.EOTA.2H₂O、肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸、蔗糖、瓊脂

配製LB細菌培養基藥品：胰蛋白腖、酵母提取物、NaCl、瓊脂

抗生素藥品：利福黴素、氨苄青黴素、頭孢黴素

 

1、植物無菌外植體的獲得：

將實驗的最初種子材料包於醫用紗布，用自來水衝洗過夜後用無菌水漂洗三次，浸入75%乙醇表麵處理1分鍾，再用10%NaClO表麵消毒10-15分鍾，經無菌水漂洗5次後接種於盛有無激素MS固體基本培養基（MS₀）的培養皿中，28℃下暗培養。及時將未汙染的發芽種子轉接到盛有MS₀固體培養基的培養皿中繼續28℃光照培養，一周後可得到無菌種子幼苗。然後將幼苗轉接到盛有MS₀固體培養基的的100ml三角瓶中28℃光照培養15-20天，得到無菌種子苗植株。

2、A₄發根農杆菌純化篩選極其工程菌液的製備

將A₄發根農杆菌原種接入LB液體培養基中28℃搖床擴增培養40-50小時，以0.3ml的接種量平鋪接種於含有利福黴素40mg/L的固體LB平板培養基上（9cm培養皿），28℃ 培養60-80小時進行菌種的純化篩選。將純化篩選得到的A₄發根農杆菌單菌落接種於LB液體培養基中增殖培養40-50小時至光密度達到0.5，製備成工程菌液。

3、 A₄發根農杆菌對外植體侵染誘導產生發狀根

切取無菌苗的下胚軸及葉片，將其倒置接於MS₀固體培養基上（使切口向上），用移液槍吸取工程菌液輕點接菌在下胚軸及葉片葉柄的切口上（同時以移液槍吸取無菌水輕點接在下胚軸及葉片葉柄的切口做為對照），暗培養2-3天後轉到含有500 mg/L頭孢黴素的固體MS₀培養基上繼代培養7-14天後從切口、胚軸及葉脈等處均可誘導出大量的發狀根。

4、 Ri-質粒轉化的初步判斷

根據發狀根的幾項重要的生物學特性來初步判斷Ri-質粒轉化（一）發狀根的發生多在母體植物的不定部位。通過A₄發根農杆菌侵染，以在葉片上特別是葉片無切傷處生出的不定根判斷極有可能是Ri-質粒轉化得到的發狀根，切取其進行除菌，並進行進一步驗證。（二）發狀根多表現為較弱的向地性。以對照的生出的不定根與侵染後葉片無切傷處生出的不定根做比較。對照生出的不定根在母體上具有很強的向地生長現象，而侵染後葉片無切傷處生出的不定根無論在母體外植體上還是離體培養中都應表現出很弱或不表現向地生長的現象。以此來對侵染後葉片無切傷處生出的不定根做進一步的判定。（三）由於轉入植物的T-DNA在植物細胞中可表達產生植物激素，因而發狀根在無激素的培養基上生長正常以及較快。同樣以對照生出的不定根與侵染後葉片無切傷處生出的不定根做比較。對照的生出的不定根剛離體後在MS₀培養基上生長極為緩慢甚至停止生長；葉片侵染後無切傷處生出的不定根離體後在MS₀培養基上繼代多次後仍然生長較快。由上可初步判斷葉片侵染後無切傷處生出的不定根是Ri-質粒轉化得到的發狀根。

5、 發狀根的除菌及其固體培養體係的建立

要建立起正常的發狀根培養體係必須經過除菌獲得無菌的發狀根。以抗生素除菌和溫度除菌相結合的方法進行除菌。抗生素除菌，即將發狀根從母體上切下後移植到含有抗生素的培養基上，經數代轉移直到完全無菌為止。溫度除菌，即將發狀根從母體上切下後移植到不含有抗生素的培養基上，在 39-40℃溫度條件下處理2天後再移到28℃下培養，發狀根恢複生長而細菌不在生長，完全達到除菌的目的。由於新生的發狀根前端細菌較少，因而除菌時將培養的發狀根前端及時地剪切下來轉移到新的培養基上，將極大的有利於細菌的去除。

經2-3次抗生素與溫度的結合除菌，得到的煙草發狀根細菌完全除淨且在MS₀固體培養基上生長正常，每4-5周可繼代1次。

6、 發狀根液體培養體係的建立

 將已經過除菌的各發狀根株係在MS₀固體培養基上擴增培養並篩選，篩選生長正常且生物量增長快的株係進行繼代擴增至一定的生物量後轉入盛有MS₀液體培養基的250ml三角瓶中28℃搖床暗培養，搖床轉速120rpm，培養20-30天即可得到一係列煙草發狀根液體培養體係。

 

附錄：

（1）LB細菌培養基配製方法

配製每升培養基，應在950ml去離子水中加入：

細菌培養用胰化蛋白腖（bacto—tryptone）：10g

細菌培養用酵母提取物（bacto— yeast extract）：5g

NaCl：10g

搖動容器直至溶質完全溶解，用5mol/L NaOH（約0.2ml）調節pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1L，在15 lbf/in²(1.034x10⁵Pa)高壓下蒸汽滅菌20分鍾。

（2）MS植物基本培養基配方表