唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米麵亞種）檢驗方法GB4789.29-2020

1 範圍

本標準規定了食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米麵亞種)[Burkholderia gladioli( Pseudomonas cocovenenans subsp. farino f ermentans>]的檢驗方法。

本標準適用於食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米麵亞種)的檢驗。

2 設備和材料

2.1 實驗室常規滅菌設備。

2.2 冰箱:2℃～8 ℃、—20℃～—30℃。

2.3 恒溫培養箱:26 ℃士l ℃,36 ℃士l ℃。

2.4 恒溫水浴鍋:46℃士l℃。

2.5 顯微鏡:10倍～100倍。

2.6 均質器。

2.7 離心機:3000 r/min。

2.8 電子天平:感量0.l g。

2.9 比濁計。

2.10 錐形瓶:容量100 mI,500 ml.。

2.11 無菌培養皿:直徑90 mm、直徑150 mm。

2.12 無菌透明玻璃紙﹑濾紙。

2.13 無菌灌胃器: l ml。

2.14 微生物生化鑒定係統。

2.15 小鼠:18 g～20 g,每一批次試驗應使用同一品係的KM或ICR小鼠。

3 培養基和試劑

3.1 GVC增菌液。

3.2 改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂(mPDA)。

3.3 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)。

3.4 PCFA培養基。

3.5 馬鈴薯葡萄糖半固體瓊脂。

3.6 卵黃瓊脂。

3.7 革蘭氏染色液。

3.8 氧化酶試劑。

3.9 Hugh-Leifson培養基(O/F試驗用)。

3.10 蛋白腖水(靛基質試驗用)。

3.11 緩衝葡萄糖蛋白腖水(MR和V-P試驗用)。

3.12 西蒙氏檸檬酸鹽培養基。

3.13 苯丙氨酸培養基。

3.14 糖發酵管。

3.15 半固體瓊脂。

3.16 抗O多價血清、型特異性因子血清(O-Ⅲ,O-Ⅳ,O-Ⅴ,O-Ⅵ,O-Ⅶ,O-Ⅷ)。

3.17 生化鑒定試劑盒。

4 檢驗程序

唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米麵亞種)檢驗程序見圖1。

5 操作步驟

5.1 樣品處理

無菌操作稱取25 g(mL)樣品,置入盛有225 mL GVC增菌液的無菌均質袋中(鮮銀耳樣品取1g，用剪刀剪碎,加入盛有20 mL.GVC增菌液的無菌均質袋中),用拍擊式均質器拍打1 min～2 min;或置入盛有225 mL GVC增菌液的無菌均質杯中,以8000 r/min～10000 r/min均質1 min～2 min;若樣品為液態,振蕩混勻。

5.2 增菌

將上述樣品增菌液置36℃士1℃培養20 h～24 h。

5.3 分離

用直徑3 mm的接種環取增菌液一環,分別劃線接種於mPDA平板和PCFA平板,36 ℃士1℃培養24 h～48 h。觀察各個平板上生長的菌落,各個平板上菌落特征見表1。

5.4 初篩試驗

自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個以上典型或可疑菌落(低於5個全選),分區劃線接種於卵黃瓊脂平板﹐36 ℃士l℃培養。挑取培養18 h～24 h的菌落進行革蘭氏染色及氧化酶試驗。對於革蘭氏染色陰性、氧化酶試驗陰性的菌繼續培養至48 h士2 h,對於卵磷脂酶陽性,帶有虹彩環的單個菌落,接種PDA平板,36 ℃士1 ℃培養24 h士2 h。

5.5 生化試驗

從純培養的PDA平板上挑取菌苔進行生化鑒定。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米麵亞種)生化特征見表2。可選擇生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定係統。

5.6 血清學分型(可選擇項)

5.6.1 菌體抗原的製備

將PDA平板36 ℃士1℃培養24 h士2 h的培養物用無菌生理鹽水洗下﹐沸水浴(100 ℃)2 h，3000 r/min 10 min離心棄上清液﹐再用無菌生理鹽水稀釋至5×108CFU/ml～1×109CFU/ml菌懸液﹐作為凝集試驗用抗原。

5.6.2 菌體抗原的鑒定

用多價血清做玻片凝集試驗,同時用生理鹽水做對照。與多價血清凝集者,依次用O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-V、O-Ⅵ、O-Ⅶ、O-Ⅷ因子血清做試管凝集試驗。根據試驗結果,判定菌體抗原型。在生理鹽水中自凝者不能分型。生化特征符合,但不能與以上血清凝集者,需保留菌株做進一步鑒定。

5.7 毒性試驗

5.7.1 產毒培養

將初步鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米麵亞種)的菌株接種PDA平板,36℃士1℃,培養24 h士2 h,用滅菌接種環刮取適量菌苔,加到3 mL無菌生理鹽水的試管中,配成1麥氏濃度(McFarland,MCF)的菌懸液(約為108CFU/mL.),用無菌吸管吸取0.5 mL,滴在鋪好無菌玻璃紙的直徑150 mm馬鈴薯葡萄糖半固體平板上,用無菌L棒塗布均勻,26 ℃士1℃培養5 d。取下帶菌的玻璃紙,將半固體平板置於100 ℃流動蒸汽滅菌30 min。室溫冷卻後,置一20 ℃～-30℃冰箱過夜。將冰凍好的半固體平板置室溫融化,用無菌吸管吸出凍融液﹐經濾紙過濾至無菌試管或錐形瓶中(此為毒素粗提液),4℃避光保存。

同時,將未接種菌苔、鋪好無菌玻璃紙的直徑150 mm馬鈴薯葡萄糖半固體平板作為陰性對照﹐按照同樣的試驗方法製備陰性對照粗提液﹐4℃避光保存。

5.7.2 毒力測定

取毒素粗提液或經100 ℃水浴蒸發後的5倍～10倍濃縮液﹐灌胃小鼠3隻，每隻0.5 mL,觀察至7 d。若菌株產生米酵菌酸﹐小鼠在灌胃後20 min～24 h內發病。主要症狀為豎毛、萎糜不振、躁動,繼而行步蹣跚、肢體麻痹、癱軟﹑抽搐,呈角弓反張狀,呼吸急促、死亡。

取陰性對照粗提液或經100 ℃水浴蒸發後的5倍～10倍濃縮液,灌胃小鼠3隻,每隻0.5 ml.,觀察至7 d。小鼠應健康存活。

5.7.3 米酵菌酸測定

毒力測定實驗陽性時,分別取毒素粗提液,陰性對照粗提液,按照GB 5009.189執行。

6 結果報告

生化試驗符合且毒性試驗陽性,報告檢出唐莒蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米麵亞種)；生化試驗和毒性試驗有一項不符合,報告未檢出唐莒蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米麵亞種)。

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附：GB4789.29唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米麵亞種）檢驗用培養基核算表 點擊下載

GB4789.29  唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米麵亞種）檢驗
用途	貨號	名稱	規格	稱量數	需求	每瓶/盒/包可做配製	單價
增菌	HB8591	GVC增菌液	250g	26g/L	225ml/樣	每瓶可配42個樣	120
分離	HB9153	改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂（mPDA)	250g	46g 每升	每個平板20ml	每瓶約300個平板	180
	HB9140	PCFA培養基	250g				280
	HB9140a	PCFA培養基添加劑	1ml*5支	每200ML加入一支   每250g需要配8包			80
初篩	待定	卵黃瓊脂培養基基礎	250g	48g 每升	每個平板20ml	每瓶約260個平板	140
	HB8295	50%卵黃乳液	5ml*10支		10支		65
	HB2100	氧化酶試紙	10片			可以使用10次	25
	HB8278	革蘭氏染色液	5ml*8			可以使用30次	40
純化	HB0233	馬鈴薯葡萄糖瓊脂	250g	46g 每升	每個平板20ml	每瓶約300個平板	160
產毒培養	HB0233-2	馬鈴薯葡萄糖半固體瓊脂	250g	31g每升			120
生化鑒定	GB049	OF生化管	20支				35
	GB117	葡萄糖	20支				30
	GB144-1	果糖	20支				35
	GB032	木糖	20支				40
	GB152	半乳糖	20支				35
	GB163	阿拉伯糖	20支				30
	GB169	蔗糖	20支				25
	GB107	核糖醇（側金盞花醇）	20支				40
	GB007	甘露醇	20支				30
	GB105	肌醇	20支				35
		衛茅醇	20支				30
	GB008	半固體瓊脂	20支				30
	GS004	尿素	20支				30
	GB066	明膠生化管	20支				40
	GB033	硝酸鹽還原	20支	需配套硝酸鹽還原試劑盒			30
	GS011	西蒙氏枸櫞酸鹽	20支				30
	GB113	L-精氨酸雙水解酶	20支				35
	SN043	氨基酸脫羧酶對照	20支				30
	HB8801	石蕊牛奶培養基	250g	101.67g每升	每管5-10ml		130
	GS001	蛋白腖水	20支	需滴加靛基質試劑盒			30
	GS003	MR-VP生化管	20支	需要配套甲基紅試劑盒、V-P試劑盒			30
	GB095	苯丙氨酸脫氨酶	20支	需滴加如下指示劑			30
	GB095a	苯丙氨酸指示劑	5ml*4				30
	GB065	硫化氫	20支				30

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