為研究無菌檢查用隔離係統環境監測平皿微生物試驗回收率的影響因素，本文對不同來源的環境監測平皿進行了測試。通過微生物的回收率作為評價指標，評估包裝材料、滅菌劑注入量、滅菌循環次數等因素對回收率的影響。結果表明，滅菌劑注入量、包裝材料和包裝形式對環境監測平皿上微生物回收率的影響較大：滅菌次數對回收率也有一定影響；金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌對汽化過氧化氫滅菌劑的敏感程度較高。隔離係統應用於無菌檢查時，應對培養基和樣品包裝進行完整性驗證，排除滅菌處理可能帶來的假陰性風險。
中國藥典2015年版(ChP 2015)首次收載了無菌檢查用隔離係統驗證指導原則，使用無菌隔離係統己成為藥品無菌檢查的趨勢。隔離係統作為傳統潔淨室的替代技術，可有效控製其內部的潔淨環境。作為一個密閉的操作係統，隔離係統通過可截留微生物的高效空氣過濾係統實現與外界的空氣交換，艙體內部采用經驗證的方式對物品進行表麵滅菌，可用於表麵滅菌的氣體有過氧化氫、二氧化氯、臭氧、過氧乙酸等，其中過氧化氫以其殺菌效果好、分解快、無殘留、對實驗用品無損害等優點最為常用。
隔離係統阻隔了操作人員和艙內潔淨環境的直接接觸，結合高效的滅菌方式，極大地降低了假陽性風險。通常在滅菌循環過程中滅菌氣體不會穿透西林瓶、安瓿、螺旋蓋試管等密封完好的容器。然而對於某些包裝物，滅菌氣體可能會對其產生不利影響，造成微生物生長的抑製，帶來假陰性風險，這是隔離係統不同於傳統潔淨室的因素，須在驗證和應用時特別關注。所以，用戶應充分評估滅菌劑是否會因為滲透試驗耗材和待檢樣品包裝，影響低水平微生物汙染的檢出。
隔離係統經過表麵滅菌，艙內可達到靜態A級潔淨度，A級環境每次開展試驗均要監測表麵微生物和沉降菌，並要定期監測浮遊菌和空氣懸浮粒子。作為最常用的環境監測平皿，胰酪大豆腖瓊脂(tryptose soya agar，TSA)培養基平皿被廣泛用於環境微生物監測。用戶一般較重視TSA平皿在使用前的培養基適用性檢查，卻容易忽視其在用於隔離係統時的包裝完整性測試，確認其經過滅菌循環後微生物的回收率是否還能達到50％～200％的要求。本研究對3種不同來源的TSA平皿進行了測試，通過微生物試驗回收率作為評價指標，評估包裝材料、滅菌循環次數、滅菌劑注入量等因素對其微生物試驗回收率的影響。
1.儀器與材料
1.1 儀器PI一4PM型單向流無菌檢查用隔離器係統(上海東富龍愛瑞思科技有限公司)；MIR-254型微生物培養箱(日本Sanyo公司)；KS一18型生物安全櫃(美國Thermo—Fisher公司)；全自動培養基滅菌和分裝係統(瑞士Integra-Biosciences公司)。
1.2 試劑和培養基30％過氧化氫溶液(分析純，國藥集團化學試劑公司)；汽化過氧化氫滅菌化學指示劑(德國Johnson&Johnson公司)；TSA培養基(成品培養基A，以下簡稱“品牌A”，某國產培養基品牌；成品培養基B，以下簡稱“品牌B”，某進口培養基品牌：自製培養基幹粉來源為德國Merck公司)。考慮到不同來源商品化成品TSA平皿的中和劑種類和添加量有所差異，為排除該差異帶來的影響，從嚴設定測試條件，本研究使用的TSA平皿均未添加中和劑。
1.3 菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMC(B)10104]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]和黑曲黴(Aspegillus niger)[CMCC(F)98003]，均購自中國醫學細菌保藏管理中心。
2.方法與結果
2.1 汽化過氧化氫穿透性測試將2個化學指示劑分別放入3種用於包裝TSA平皿的單層包材中並封口，采用滅菌程序B(過氧化氫注入量約為1 00 g／m3)進行一次滅菌循環，滅菌結束後觀察化學指示劑的變色情況，共進行3次測試，以研究汽化過氧化氫穿透包材的能力。
結果如表1所示，汽化過氧化氫能夠穿透紙塑包裝，60 g／m3醫用透析紙相對於70 g／m3醫用透析紙包裝更易被穿透，而汽化過氧化氫不能穿透聚酰胺／聚乙烯(PA／PE)複合膜和聚丙烯+聚乙烯．乙烯／乙烯醇共聚物一聚乙烯(PP一(PE．EVOH—PE))共擠膜包裝。
2.2 單層包裝各試驗菌的回收率
將2種商品化成品TSA平皿拆掉外部兩層包裝，保留單層包裝，自製平皿僅作單層包裝，試驗組放入隔離器係統操作艙內，分別用4種不同的模式進行表麵滅菌處理：
(1)滅菌程序A(過氧化氫注入量約為50 g／m3)進行一次滅菌循環；
(2)滅菌程序A進行連續兩次滅菌循環；
(3)滅菌程序B(過氧化氫注入量約為100 g／m3)進行一次滅菌循環；
(4)滅菌程序B進行連續兩次滅菌循環。每種模式分別進行3次測試。
滅菌程序A和B均經過滅菌驗證，均能使生物指示劑下降超過6個對數值，可用於日常無菌檢查。同步設置陽性對照組，不進行表麵滅菌處理。
表麵滅菌結束後，將試驗組TSA平皿轉移至生物安全櫃內，和陽性對照組TSA平皿同步進行塗布試驗，塗布用的5種試驗菌按照ChP 2015四部通則1105的規定，製成含菌量不超過100 CFu的菌懸液，每種試驗菌平行塗布2塊平皿，塗布完成後置規定條件培養。
如表2所示，在單層包裝試驗條件下，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌對汽化過氧化氫滅菌的敏感程度較高，品牌A在滅菌劑注入量達到100 g／m3時，金黃色葡萄球菌的平均回收率小於50％，在滅菌劑注入量達到200 g／m3時，銅綠假單胞菌的平均回收率為44．6％，金黃色葡萄球菌的回收率低至18．6％。枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲黴則對過氧化氫滅菌氣體的敏感程度較低，3種TSA平皿在4種滅菌模式下的平均回收率均達到了90％以上。
2.3雙層包裝各試驗菌的回收率
根據單層包裝試驗結果，補充了以下試驗：將2種商品化成品TSA平皿保留兩層包裝，自製平皿作兩層包裝，試驗組放入隔離器係統操作艙內，分別按“2．2”項下的四種模式進行表麵滅菌處理，陽性對照組不進行表麵滅菌處理。表麵滅菌結束後，按“2．2”項下方法進行塗布試驗，試驗菌為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。
結果如表3所示，品牌A在保留雙層包裝後，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌在4種滅菌模式下的微生物試驗回收率均達到了80％以上，品牌B和自製平皿的微生物試驗回收率仍保持在80％以上。
商品化的環境采樣平皿包裝常含有透氣組件，在隔離係統的表麵滅菌處理過程中，滅菌劑可能存在穿透作用。此次研究通過化學指示劑試驗發現在隔離係統常用的汽化過氧化氫滅菌方式處理下，PA／PE複合膜和PP一(PE—EVOH—PE)共擠膜包裝不易被穿透，而紙塑包裝形式可能被汽化過氧化氫穿透，穿透滲入的過氧化氫可能會對采樣平皿造成不利影響，而通過微生物回收率試驗可以直觀地驗證其效果。本次研究發現確實存在汽化過氧化氫穿透紙塑包裝從而影響培養基性能的情況，而較薄規格的紙塑包裝相對於較厚規格的包裝受影響更為明顯。
3.討論
目前市麵上的商品化環境監測培養基多為三層無菌包裝，該設計主要針對潔淨室不同潔淨級別間的傳遞需要，而隔離係統采用高效的表麵滅菌，包裝材料對汽化過氧化氫的滲透和吸附作用會影響包裝內環境監測平皿的微生物試驗回收率。建議用戶不必拘泥於是否一定拆至單層包裝，而是要考慮包裝材質和滅菌過程的適應性。滅菌次數對紙塑包裝平皿的微生物試驗回收率有一定程度的影響，用戶可根據隔離係統所使用的滅菌劑特點，選擇添加中和劑的環境菌測試平皿，一定程度上可以消除滅菌氣體的抑菌作用。
汽化過氧化氫作為一種典型的低溫蒸汽滅菌方式，其滅菌過程中的影響因素較為複雜，而滅菌劑的注入量是影響過氧化氫滅菌效果的關鍵因素。本次研究也發現滅菌劑注入量明顯影響了敏感菌株的回收率，甚至可能達不到藥典規定的回收率要求，用戶應根據生產廠商的使用要求、自身工作需要等綜合測試評估，開發出合理的滅菌程序，避免因盲目追求過量殺滅造成滅菌劑殘留和假陰性風險增加等問題。滅菌循環次數、滅菌劑注入量作為隔離係統滅菌程序的一部分，是經開發驗證固定下來的，在此基礎上用戶可對TSA平皿的包裝材料與滅菌程序的兼容性進行驗證，若通過可不必重複驗證。滅菌程序或包裝材料任意一方更改時，應重新驗證。建議使用經驗證的滅菌程序進行不少於兩次連續滅菌，以此嚴苛條件對包裝材料的包裝完整性進行測試。本次研究也發現，有些試驗菌對過氧化氫表麵滅菌表現出較強的耐受能力，而有些試驗菌則較為敏感，建議用戶在進行環境監測平皿的包裝完整性研究時重點關注，另外可以增加曆史環境菌作為測試菌株。
需要說明的是，本文提供的環境監測平皿包裝完整性測試思路可供其他案例參考，但本文中所測試的微生物回收率結果不能直接使用，因為不同案例隔離係統滅菌程序的差異，所測試的環境菌平皿培養基來源的差異、包裝材料的差異都會影響最終結果，應以各案例實際測試結果為準。
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