一、培養基用途和原理：
ONPG培養基用於各類革蘭氏陰性杆菌β－半乳糖苷酶的產生能力。也可用於鑒別遲緩發酵乳糖細菌與乳糖陰性細菌，還可將ONPG陽性的蔥頭假單胞菌（Pseudomonas copacia）及嗜麥芽假單胞菌（Pseudomonas maltophila ）與其它假單胞菌區分開。陽性菌可使培養基變黃，故不宜用於檢測黃色細菌。
該培養基的原理為，細菌分解乳糖依靠兩種酶的作用，一種是β－半乳糖苷酶滲透酶（βeta-galactosidase permease），它位於細胞膜上，可送乳糖分子滲入細胞。另一種為β－半乳糖苷酶（βeta-galactosidase），也稱乳糖酶（Lactase），位於細胞內，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。
具有上述兩種酶的細菌，能在24-48h發酵乳糖，而缺乏此兩種酶的細菌，不能分解乳糖，乳糖遲緩發酵菌隻有β-D-半乳糖苷酶（胞內酶）而缺乏β－半乳糖苷酶滲透酶，因而乳糖進入細菌細胞很慢，須經培養基中１％乳糖較長時間的誘導，產生相當數量的滲透酶後，才能較快分解乳糖，故呈現遲緩發酵現象。
ONPG可迅速進入細菌細胞，被半乳糖苷酶水解，釋放出黃色的鄰位硝基苯酚（O-nitrophenol,ONP），故由培養液變黃可迅速測知β－半乳糖苷酶的存在，從而確定該菌為乳糖遲緩發酵菌。
二、試驗結果判斷：
接種微量新鮮培養物，35℃培養13小時，觀察結果。培養液變黃則為陽性，如為陰性，繼續觀察至24h。
三、質控菌株：
陽性菌株：大腸埃希氏菌
陰性菌株：普通變形杆菌
四、使用說明：
（1）ONPG的優點為水解作用快。在有較多乳糖苷酶存在的情況下，可在數分鍾內被水解而變黃。將較大量細菌培養物接種於小量ONPG培養基中，常可在１小時內獲得陽性結果。
（2）葡萄糖對β－半乳糖苷酶有一定的抑製作用，故應避免使用。
（3）使用生長於含乳糖培養基的細菌進行接種，如三糖鐵瓊脂斜麵上的培養物，可能加速試驗反應。
（4）日本阪崎介紹，β－半乳糖苷酶和ONPG試驗反應不一定具有相關性。Leminor氏等用腸道菌研究了兩者的相關性，他講ONPG試驗陽性菌分為兩群。ONPG＋β-gal＋群細菌的ONPG試驗在4小時內為強陽性，但ONPG＋β-gal－群細菌的ONPG試驗較弱，而且緩慢變為陽性。
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