大腸菌群是指在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞杆菌。
直接或間接來自人與溫血動物的腸道：包括腸杆菌科的大腸埃希氏菌屬、檸檬酸杆菌屬、腸杆菌屬和克雷伯菌屬，其中大腸埃希氏菌屬為最典型大腸埃希氏菌。
人與溫血動物糞便汙染的指示菌：
• 大腸埃希氏菌——糞便近期汙染；
• 其他菌屬——糞便陳舊汙染。
腸道致病菌汙染食品的指示菌：
• 與腸道致病菌（如沙門氏菌、誌賀氏菌）來源相同；在外界生存的時間與主要腸道致病菌一致。
二、修訂的主要內容
本標準與GB4789.2-2010相比，主要修改如下：
1、刪除了標準的英文名稱
2、修改了發布單位名稱
2010版本“中華人民共和國衛生部”
2016版本“中華人民共和國國家衛生盒計劃生育委員會”和“國家食品藥品監督管理總局”
3、前言：
本標準代替GB4789.3—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》、GB/T4789.32—2002《食品衛生微生物學檢驗 大腸菌群的快速檢測》和SN/T0169—2010《進出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸杆菌檢測方法》大腸菌群計數部分。
本標準與GB4789.3—2010相比,主要變化如下:
———增加了檢驗原理;
———修改了適用範圍;
———修改了典型菌落的形態描述;
———修改了第二法平板菌落數的選擇;
———修改了第二法證實試驗;
———修改了第二法平板計數的報告。
三、大腸菌群計數的兩種方法
第一法 MPN法
適用於大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計數。
檢驗原理：MPN法是統計學和微生物學結合的一種定量檢測法。待測樣品經係列稀釋並培養後,根據其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度,應用統計學概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數。
第二法 平板計數法
適用於大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群的計數。
檢驗原理：大腸菌群在固體培養基中發酵乳糖產酸,在指示劑的作用下形成可計數的紅色或紫色,帶有或不帶有沉澱環的菌落。
MPN法檢驗操作
第一步：樣品稀釋
1 固體和半固體樣品:稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質杯內8000r/min~10000r/min均質1min~2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min~2min,製成1∶10的樣品勻液。
2 液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置於機械振蕩器中振搖,充分混勻,製成1∶10的樣品勻液。
3 樣品勻液的pH 應在6.5~7.5之間,必要時分別用1mol/LNaOH 或1mol/LHCl調節。
4 用1mL 無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液麵),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反複吹打,使其混合均勻,製成1∶100的樣品勻液。
5 根據對樣品汙染狀況的估計,按上述操作,依次製成十倍遞增係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從製備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15min。
第二步：初發酵試驗
每個樣品,選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白腖(LST)肉湯,每管接種1mL(如接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯),36℃±1℃ 培養24h±2h,觀察倒管內是否有氣泡產生,24h±2h產氣者進行複發酵試驗(證實試驗),如未產氣則繼續培養至48h±2h,產氣者進行複發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。
初發酵實驗培養基：月桂基硫酸鹽蛋白腖肉湯（LST）
成分
胰蛋白腖20.0g提供氮源
氯化鈉5.0g調節滲透壓
乳糖5.0g提供碳源、指示係統
磷酸氫二鉀2.75g調節pH
磷酸二氫鉀2.75g調節pH
月桂基硫酸鈉0.1g抑製革蘭氏陽性菌生長
PH值6.8±0.2 25℃
用 法
稱取本品35.6克，加熱溶解於1000ml蒸餾水中，分裝到有倒立發酵管的20mm×150mm試管中，每管10ml，121℃高壓滅菌15分鍾，備用。
第三步：複發酵試驗(證實試驗)
用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1 環,移種於煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管中,36℃±1℃培養48h±2h,觀察產氣情況。產氣者,計為大腸菌群陽性管。
複發酵實驗培養基：煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）
成分
蛋白腖10.0g提供氮源
乳糖10.0g提供碳源並作為指示劑
牛膽粉(oxgall或oxbile)溶液200mL抑製革蘭陽性菌生長
0.1%煌綠水溶液13.3mL抑製革蘭陽性菌和部分陰性菌生長
蒸餾水800ml
pH值 7.2±0.1 25℃
第四步：大腸菌群最可能數(MPN)的報告
按確證的大腸菌群BGLB陽性管數,檢索MPN 表,報告每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN 值。
模式：大腸菌群（MPN/g） <0.3
大腸菌群（MPN/ml）<0.03
稀釋度的選擇
依據國家食品安全標準，一般情況下：
固體樣品選作1g*3、0.1g*3、0.01g*3，若結果全部陰性，報告為<0.3MPN/g；若有陽性管，查表，表中數字除以10報告。
液體樣品選作10ml*3、1ml*3、0.01ml*3，若結果全部陰性，報告為<0.03MPN/g；若有陽性管，查表，表中數字除以100報告。
平板計數法檢驗操作
第一步：樣品的稀釋
同MPN法。
第二步：平板計數
1 選取2個~3個適宜的連續稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿,每皿1mL。同時取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。
2 及時將15mL~20mL融化並恒溫至46℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)約傾注於每個平皿中。小心旋轉平皿,將培養基與樣液充分混勻,待瓊脂凝固後,再加3mL~4mLVRBA 覆蓋平板表層。翻轉平板,置於36℃±1℃培養18h~24h。
所用培養基：結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)
成分
蛋白腖7.0g提供氮源
酵母膏3.0g提供氮源，生長因子
乳糖10.0g提供碳源、指示劑
氯化鈉5.0g維持滲透壓
膽鹽或3號膽鹽1.5g抑製革蘭氏陽性菌生長
中性紅0.03g pH指示劑
結晶紫0.002g抑製革蘭氏陽性菌生長
瓊脂15g~18g凝固劑
蒸餾水1000mL
製法
將上述成分溶於蒸餾水中,靜置幾分鍾,充分攪拌,調節pH 至7.4±0.1。煮沸2min,將培養基融化並恒溫至45℃~50℃傾注平板。使用前臨時製備,不得超過3h。
第三步：平板菌落數的選擇
選取菌落數在15CFU~150CFU 之間的平板,分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落(如菌落直徑較典型菌落小)。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉澱環,菌落直徑為0.5mm或更大,最低稀釋度平板低於15CFU 的記錄具體菌落數。
第四步：證實試驗
從VRBA 平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落,少於10個菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種於BGLB肉湯管內,36℃±1℃培養24h~48h,觀察產氣情況。凡BGLB肉湯管產氣,即可報告為大腸菌群陽性。
第五步：大腸菌群平板計數的報告
經最後證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以9.3中計數的平板菌落數,再乘以稀釋倍數,即為每g(mL)樣品中大腸菌群數。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA 平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數為:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小於1乘以最低稀釋倍數計算。
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