前 言
本標準代替GB4789.30—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》。
本標準與GB4789.30—2010相比,主要變化如下:
———增加了“第二法 單核細胞增生李斯特氏菌平板計數法”;
———增加了“第三法 單核細胞增生李斯特氏菌MPN 計數法”;
———修改了範圍。
1 範圍
本標準規定了食品中單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的檢驗方法。
本標準第一法適用於食品中單核細胞增生李斯特氏菌的定性檢驗;第二法適用於單核細胞增生李斯特氏菌含量較高的食品中單核細胞增生李斯特氏菌的計數;第三法適用於單核細胞增生李斯特氏菌含量較低(<100CFU/g)而雜菌含量較高的食品中單核細胞增生李斯特氏菌的計數,特別是牛奶、水以及含幹擾菌落計數的顆粒物質的食品。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
2.1 冰箱:2℃~5℃。
2.2 恒溫培養箱:30℃±1℃、36℃±1℃。
2.3 均質器。
2.4 顯微鏡:10x~100x。
2.5 電子天平:感量0.1g。
2.6 錐形瓶:100mL、500mL。
2.7 無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。
2.8 無菌平皿:直徑90mm。
2.9 無菌試管:16mm×160mm。
2.10 離心管:30mm×100mm。
2.11 無菌注射器:1mL。
2.12 單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111或CMCC54004,或其他等效標準菌株。
2.13 英諾克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090,或其他等效標準菌株。
2.14 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119,或其他等效標準菌株。
2.15 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)ATCC35967,或其他等效標準菌株。
2.16 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923或其他產β-溶血環金葡菌,或其他等效標準菌株。
2.17 馬紅球菌(Rhodococcusequi)ATCC6939或NCTC1621,或其他等效標準菌株。
2.18 小白鼠:ICR體重18g~22g。
2.19 全自動微生物生化鑒定係統。
3 培養基和試劑
3.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪腖大豆肉湯(TSB-YE):見A.1。
3.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪腖大豆瓊脂(TSA-YE):見A.2。
3.3 李氏增菌肉湯LB(LB1,LB2):見A.3。
3.4 1%鹽酸吖啶黃(acriflavineHCl)溶液:見A.3.2.1、A.3.2.2。
3.5 1%萘啶酮酸鈉鹽(naladixicacid)溶液:見A.3.2.1、A.3.2.2。
3.6 PALCAM 瓊脂:見A.4。
3.7 革蘭氏染液:見A.5。
3.8 SIM 動力培養基:見A.6。
3.9 緩衝葡萄糖蛋白腖水[甲基紅(MR)和V-P試驗用]:見A.7。
3.10 5%~8%羊血瓊脂:見A.8。
3.11 糖發酵管:見A.9。
3.12 過氧化氫試劑:見A.10。
3.13 李斯特氏菌顯色培養基。
3.14 生化鑒定試劑盒或全自動微生物鑒定係統。
3.15 緩衝蛋白腖水:見A.11。
第一法 單核細胞增生李斯特氏菌定性檢驗
4 檢驗程序
單核細胞增生李斯特氏菌定性檢驗程序見圖1。
5 操作步驟
5.1 增菌
以無菌操作取樣品25g(mL)加入到含有225mLLB1 增菌液的均質袋中,在拍擊式均質器上連續均質1min~2min;或放入盛225mLLB1 增菌液的均質杯中,以8000r/min~10000r/min均質1min~2min。於30℃±1℃培養24h±2h,移取0.1mL,轉種於10mLLB2 增菌液內,於30 ℃±1℃ 培養24h±2h。
5.2 分離
取LB2 二次增菌液劃線接種於李斯特氏菌顯色平板和PALCAM 瓊脂平板,於36 ℃±1 ℃培養24h~48h,觀察各個平板上生長的菌落。典型菌落在PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落,周圍有棕黑色水解圈,有些菌落有黑色凹陷;在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征,參照產品說明進行判定。
5.3 初篩
自選擇性瓊脂平板上分別挑取3個~5個典型或可疑菌落,分別接種木糖、鼠李糖發酵管,於36℃±1℃ 培養24h±2h,同時在TSA-YE平板上劃線,於36℃±1℃培養18h~24h,然後選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養物繼續進行鑒定。
5.4 鑒定(或選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物鑒定係統等)
5.4.1 染色鏡檢:李斯特氏菌為革蘭氏陽性短杆菌,大小為(0.4μm~0.5μm)×(0.5μm~2.0μm);用生理鹽水製成菌懸液,在油鏡或相差顯微鏡下觀察,該菌出現輕微旋轉或翻滾樣的運動。
5.4.2 動力試驗:挑取純培養的單個可疑菌落穿刺半固體或SIM 動力培養基,於25 ℃~30 ℃培養48h,李斯特氏菌有動力,在半固體或SIM 培養基上方呈傘狀生長,如傘狀生長不明顯,可繼續培養5d,再觀察結果。
5.4.3 生化鑒定:挑取純培養的單個可疑菌落,進行過氧化氫酶試驗,過氧化氫酶陽性反應的菌落繼續進行糖發酵試驗和MR-VP試驗。單核細胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見表1。
5.4.4 溶血試驗:將新鮮的羊血瓊脂平板底麵劃分為20個~25個小格,挑取純培養的單個可疑菌落刺種到血平板上,每格刺種一個菌落,並刺種陽性對照菌(單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和陰性對照菌(英諾克李斯特氏菌),穿刺時盡量接近底部,但不要觸到底麵,同時避免瓊脂破裂,36℃±1℃培養24h~48h,於明亮處觀察,單增李斯特氏菌呈現狹窄、清晰、明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺種點周圍產生弱的透明溶血圈,英諾克李斯特氏菌無溶血圈,伊氏李斯特氏菌產生寬的、輪廓清晰的β-溶血區域,若結果不明顯,可置4℃冰箱24h~48h再觀察。
注:也可用劃線接種法。
5.4.5 協同溶血試驗cAMP(可選項目):在羊血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌,挑取純培養的單個可疑菌落垂直劃線接種於平行線之間,垂直線兩端不要觸及平行線,距離1mm~2mm,同時接種單核細胞增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌,於36℃±1℃培養24h~48h。單核細胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現約2mm 的β-溶血增強區域,斯氏李斯特氏菌也出現微弱的溶血增強區域,伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現約5mm~10mm 的“箭頭狀”β-溶血增強區域,英諾克李斯特氏菌不產生溶血現象。若結果不明顯,可置4℃冰箱24h~48h再觀察。
注:5%~8%的單核細胞增生李斯特氏菌在馬紅球菌一端有溶血增強現象。
表1 單核細胞增生李斯特氏菌生化特征與其他李斯特氏菌的區別
5.5 小鼠毒力試驗(可選項目)
將符合上述特性的純培養物接種於TSB-YE中,於36℃±1℃培養24h,4000r/min離心5min,棄上清液,用無菌生理鹽水製備成濃度為1010 CFU/mL的菌懸液,取此菌懸液對3隻~5隻小鼠進行腹腔注射,每隻0.5mL,同時觀察小鼠死亡情況。接種致病株的小鼠於2d~5d內死亡。試驗設單增李斯特氏菌致病株和滅菌生理鹽水對照組。單核細胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌對小鼠有致病性。
5.6 結果與報告
綜合以上生化試驗和溶血試驗的結果,報告25g(mL)樣品中檢出或未檢出單核細胞增生李斯特氏菌。
第二法 單核細胞增生李斯特氏菌平板計數法
6 檢驗程序
單核細胞增生李斯特氏菌平板計數程序見圖2。
7 操作步驟
7.1 樣品的稀釋
7.1.1 以無菌操作稱取樣品25g(mL),放入盛有225mL 緩衝蛋白腖水或無添加劑的LB肉湯的無菌均質袋內(或均質杯)內,在拍擊式均質器上連續均質1min~2min或以8000r/min~10000r/min均質1min~2min。液體樣品,振蕩混勻,製成1∶10的樣品勻液。
7.1.2 用1mL 無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注於盛有9mL緩衝蛋白腖水或無添加劑的LB肉湯的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液麵),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反複吹打使其混合均勻,製成1∶100的樣品勻液。
7.1.3 按7.1.2操作程序,製備10倍係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。
7.2 樣品的接種
根據對樣品汙染狀況的估計,選擇2個~3個適宜連續稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),每個稀釋度的樣品勻液分別吸取1mL以0.3mL、0.3mL、0.4mL的接種量分別加入3塊李斯特氏菌顯色平板,用無菌L 棒塗布整個平板,注意不要觸及平板邊緣。使用前,如瓊脂平板表麵有水珠,可放在25℃~50℃的培養箱裏幹燥,直到平板表麵的水珠消失。
7.3 培養
7.3.1 在通常情況下,塗布後,將平板靜置10min,如樣液不易吸收,可將平板放在培養箱36℃±1℃培養1h;等樣品勻液吸收後翻轉平皿,倒置於培養箱,36℃±1℃培養24h~48h。
7.4 典型菌落計數和確認
7.4.1 單核細胞增生李斯特氏菌在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征以產品說明為準。
7.4.2 選擇有典型單核細胞增生李斯特氏菌菌落的平板,且同一稀釋度3 個平板所有菌落數合計在15CFU~150CFU 之間的平板,計數典型菌落數。如果:
a) 隻有一個稀釋度的平板菌落數在15CFU~150CFU 之間且有典型菌落,計數該稀釋度平板上的典型菌落;
b) 所有稀釋度的平板菌落數均小於15CFU 且有典型菌落,應計數最低稀釋度平板上的典型菌落;
c) 某一稀釋度的平板菌落數大於150CFU 且有典型菌落,但下一稀釋度平板上沒有典型菌落,應計數該稀釋度平板上的典型菌落;
d) 所有稀釋度的平板菌落數大於150CFU 且有典型菌落,應計數最高稀釋度平板上的典型菌落;
e) 所有稀釋度的平板菌落數均不在15CFU~150CFU 之間且有典型菌落,其中一部分小於15CFU 或大於150CFU時,應計數最接近15CFU或150CFU的稀釋度平板上的典型菌落。
以上按式(1)計算。
f) 2個連續稀釋度的平板菌落數均在15CFU~150CFU 之間,按式(2)計算。
7.4.3 從典型菌落中任選5個菌落(小於5個全選),分別按5.3、5.4進行鑒定。
8 結果計數
T =AB/Cd …………………………(1)
式中:
T ———樣品中單核細胞增生李斯特氏菌菌落數;
A ———某一稀釋度典型菌落的總數;
B ———某一稀釋度確證為單核細胞增生李斯特氏菌的菌落數;
C ———某一稀釋度用於單核細胞增生李斯特氏菌確證試驗的菌落數;
d ———稀釋因子。
T =（A1B1/C1 +A2B2/C2）/1.1d …………………………(2)
式中:
T ———樣品中單核細胞增生李斯特氏菌菌落數;
A1 ———第一稀釋度(低稀釋倍數)典型菌落的總數;
B1 ———第一稀釋度(低稀釋倍數)確證為單核細胞增生李斯特氏菌的菌落數;
C1 ———第一稀釋度(低稀釋倍數)用於單核細胞增生李斯特氏菌確證試驗的菌落數;
A2 ———第二稀釋度(高稀釋倍數)典型菌落的總數;
B2 ———第二稀釋度(高稀釋倍數)確證為單核細胞增生李斯特氏菌的菌落數;
C2 ———第二稀釋度(高稀釋倍數)用於單核細胞增生李斯特氏菌確證試驗的菌落數;
1.1 ———計算係數;
d ———稀釋因子(第一稀釋度)。
9 結果報告
報告每g(mL)樣品中單核細胞增生李斯特氏菌菌數,以CFU/g(mL)表示;如T 值為0,則以小於1乘以最低稀釋倍數報告。
第三法 單核細胞增生李斯特氏菌MPN 計數法
10 檢驗程序
單核細胞增生李斯特氏菌MPN 計數法檢驗程序見圖3。
11 操作步驟
11.1 樣品的稀釋
按7.1進行。
11.2 接種和培養
11.2.1 根據對樣品汙染狀況的估計,選取3個適宜連續稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),接種於10mLLB1 肉湯,每一稀釋度接種3管,每管接種1mL(如果接種量需要超過1mL,則用雙料LB1增菌液)於30℃±1℃培養24h±2h。每管各移取0.1mL,轉種於10mLLB2 增菌液內,於30℃±1℃ 培養24h±2h。
11.2.2 用接種環從各管中移取1環,接種李斯特氏菌顯色平板,36℃±1℃培養24h~48h。
11.3 確證試驗
自每塊平板上挑取5個典型菌落(5個以下全選),按照5.3、5.4進行鑒定。
12 結果與報告
根據證實為單核細胞增生李斯特氏菌陽性的試管管數,查MPN 檢索表(見附錄B),報告每g(mL)
樣品中單核細胞增生李斯特氏菌的最可能數,以MPN/g(mL)表示。
附 錄 A
培養基和試劑
A.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪腖大豆肉湯(TSB-YE)
A.1.1 成分
胰腖17.0g
多價腖3.0g
酵母膏6.0g
氯化鈉5.0g
磷酸氫二鉀2.5g
葡萄糖2.5g
蒸餾水1000mL
A.1.2 製法
將上述各成分加熱攪拌溶解,調節pH 至7.2±0.2,分裝,121℃高壓滅菌15min,備用。
A.2 含0.6%酵母膏的胰酪腖大豆瓊脂(TSA-YE)
A.2.1 成分
胰腖17.0g
多價腖3.0g
酵母膏6.0g
氯化鈉5.0g
磷酸氫二鉀2.5g
葡萄糖2.5g
瓊脂15.0g
蒸餾水1000mL
A.2.2 製法
將上述各成分加熱攪拌溶解,調節pH 至7.2±0.2,分裝,121℃高壓滅菌15min,備用。
A.3 李氏增菌肉湯(LB1,LB2)
A.3.1 成分
胰腖5.0g
多價腖5.0g
酵母膏5.0g
氯化鈉20.0g
磷酸二氫鉀1.4g
磷酸氫二鈉12.0g
七葉苷1.0g
蒸餾水1000mL
A.3.2 製法
將上述成分加熱溶解,調節pH 至7.2±0.2,分裝,121℃高壓滅菌15min,備用。
A.3.2.1 李氏Ⅰ液(LB1)225mL中加入:
1%萘啶酮酸(用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配製)0.5mL
1% 吖啶黃(用無菌蒸餾水配製) 0.3mL
A.3.2.2 李氏Ⅱ液(LB2)200mL中加入:
1%萘啶酮酸0.4mL
1%吖啶黃0.5mL
A.4 PALCAM 瓊脂
A.4.1 成分
酵母膏8.0g
葡萄糖0.5g
七葉甙0.8g
檸檬酸鐵銨0.5g
甘露醇10.0g
酚紅0.1g
氯化鋰15.0g
酪蛋白胰酶消化物10.0g
心胰酶消化物3.0g
玉米澱粉1.0g
肉胃酶消化物5.0g
氯化鈉5.0g
瓊脂15.0g
蒸餾水1000mL
A.4.2 製法
將上述成分加熱溶解,調節pH 至7.2±0.2,分裝,121℃高壓滅菌15min,備用。
A.4.2.1 PALCAM 選擇性添加劑
多粘菌素B 5.0mg
鹽酸吖啶黃2.5mg
頭孢他啶10.0mg
無菌蒸餾水500mL
A.4.2.2 製法
將PALCAM 基礎培養基溶化後冷卻到50℃,加入2mLPALCAM 選擇性添加劑,混勻後傾倒在無菌的平皿中,備用。
A.5 革蘭氏染色液
A.5.1 結晶紫染色液
A.5.1.1 成分
結晶紫1.0g
95%乙醇20.0mL
1%草酸銨水溶液80.0mL
A.5.1.2 製法
將結晶紫完全溶解於乙醇中,然後與草酸銨溶液混合。
A.5.2 革蘭氏碘液
A.5.2.1 成分
碘1.0g
碘化鉀2.0g
蒸餾水300mL
A.5.2.2 製法
將碘與碘化鉀先進行混合,加入蒸餾水少許,充分振搖,待完全溶解後,再加蒸餾水至300mL。
A.5.3 沙黃複染液
A.5.3.1 成分
沙黃0.25g
95%乙醇10.0mL
蒸餾水90.0mL
A.5.3.2 製法
將沙黃溶解於乙醇中,然後用蒸餾水稀釋。
A.5.4 染色法
A.5.4.1 塗片用火焰固定後滴加結晶紫染液,作用1min,水洗。
A.5.4.2 滴加革蘭氏碘液,作用1min,水洗。
A.5.4.3 滴加95%乙醇脫色,約15s~30s,直至染色液被洗掉,不要過分脫色,水洗。
A.5.4.4 滴加複染液,複染1min,水洗、待幹、鏡檢。
A.6 SIM 動力培養基
A.6.1 成分
胰腖20.0g
多價腖6.0g
硫酸鐵銨0.2g
硫代硫酸鈉0.2g
瓊脂3.5g
蒸餾水1000mL
A.6.2 製法
將上述各成分加熱混勻,調節pH 至7.2±0.2,分裝小試管,121℃高壓滅菌15min,備用。
A.6.3 試驗方法
挑取純培養的單個可疑菌落穿刺接種到SIM 培養基中,於25℃~30℃培養48h,觀察結果。
A.7 緩衝葡萄糖蛋白腖水(MR 和VP試驗用)
A.7.1 成分
多價腖7.0g
葡萄糖5.0g
磷酸氫二鉀5.0g
蒸餾水1000mL
A.7.2 製法
溶化後調節pH 至7.0±0.2,分裝試管,每管1mL,121℃高壓滅菌15min,備用。
A.7.3 甲基紅(MR)試驗
A.7.3.1 甲基紅試劑
A.7.3.1.1 成分
甲基紅10mg
95%乙醇30mL
蒸餾水20mL
A.7.3.1.2 製法
10mg甲基紅溶於30mL95%乙醇中,然後加入20mL蒸餾水。
A.7.3.1.3 試驗方法
取適量瓊脂培養物接種於緩衝葡萄糖蛋白腖水中,36℃±1℃培養2d~5d。滴加甲基紅試劑一滴,立即觀察結果。鮮紅色為陽性,黃色為陰性。
A.7.4 V-P試驗
A.7.4.1 6% α-萘酚-乙醇溶液
成分及製法:取α-萘酚6.0g,加無水乙醇溶解,定容至100mL。
A.7.4.2 40%氫氧化鉀溶液
成分及製法:取氫氧化鉀40g,加蒸餾水溶解,定容至100mL。
A.7.4.3 試驗方法
取適量瓊脂培養物接種於緩衝葡萄糖蛋白腖水中,36℃±1℃培養2d~4d。加入6% α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氫氧化鉀溶液0.2mL,充分振搖試管,觀察結果。陽性反應立刻或於數分鍾內出現紅色,如為陰性,應放在36℃±1℃繼續培養1h再進行觀察。
A.8 血瓊脂
A.8.1 成分
蛋白腖1.0g
牛肉膏0.3g
氯化鈉0.5g
瓊脂1.5g
蒸餾水100mL
脫纖維羊血5mL~8mL
A.8.2 製法
除新鮮脫纖維羊血外,加熱溶化上述各組分,121℃高壓滅菌15min,冷到50℃,以無菌操作加入新鮮脫纖維羊血,搖勻,傾注平板。
A.9 糖發酵管
A.9.1 成分
牛肉膏5.0g
蛋白腖10.0g
氯化鈉3.0g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 2.0g
0.2%溴麝香草酚藍溶液12.0mL
蒸餾水1000mL
A.9.2 製法
A.9.2.1 葡萄糖發酵管按上述成分配好後,按0.5%比例加入葡萄糖,分裝於有一個倒置小管的小試管內,調節pH 至7.4,115℃高壓滅菌15min,備用。
A.9.2.2 其他各種糖發酵管可按上述成分配好後,分裝每瓶100mL,115℃高壓滅菌15min。另將各種糖類分別配好10%溶液,同時高壓滅菌。將5mL糖溶液加入於100mL培養基內,以無菌操作分裝於含倒置小管的小試管中。或按照A.9.2.1葡萄糖發酵管的配製方法製備其他糖類發酵管。
A.9.3 試驗方法
取適量純培養物接種於糖發酵管,36 ℃±1 ℃培養24h~48h,觀察結果,藍色為陰性,黃色為陽性。
A.10 過氧化氫酶試驗
A.10.1 試劑
3%過氧化氫溶液:臨用時配製。
A.10.2 試驗方法
用細玻璃棒或一次性接種針挑取單個菌落,置於潔淨玻璃平皿內,滴加3%過氧化氫溶液2滴,觀察結果。
A.10.3 結果
於半分鍾內發生氣泡者為陽性,不發生氣泡者為陰性。
A.11 緩衝蛋白腖水(BPW)
A.11.1 成分
蛋白腖10.0g
氯化鈉5.0g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 9.0g
磷酸二氫鉀1.5g
蒸餾水1000mL
A.11.2 製法
加熱攪拌至溶解,調節pH 至7.2±0.2,121℃高壓滅菌15min。
附 錄 B
單核細胞增生李斯特氏菌最可能數(MPN)檢索表
每g(mL)檢樣中單核細胞增生李斯特氏菌最可能數(MPN)檢索表見表B.1。
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