前言
本標準代替GB4789.15-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗黴菌和群母計數》和SN/T 2552.3-2010《乳及乳製品衛生微生物學檢驗方法第3部份：酵母、黴菌菌落計數》。
本標準與GB 4789.15-2010相比.主要變化如下:
一修改了設各和材料;
一修改了培養基和試劑;
一修改了檢驗程序和操作步驟;
一修改了結果與報告;
一修改了附錄A;
一附錄B修改為第二法。
1 範圍
本標準規定了食品中黴菌和酵母(moulds and yeasts)的計數方法。
本標準第一法適用於各類食品中黴菌和酵母的計數,第二法適用於番茄醬罐頭、番茄汁申黴菌的計數。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
2.1培養箱:28℃±1℃。
2.2 拍擊式均質器及均質袋。
2.3 電子天平,感量0.1g。
2.4 無菌錐形瓶:容量500mL。
2.5 無茵吸管:1 mL(具0.01 mL刻度).10mL(具0.1 mL刻度)。
2.6 無菌試管: 18mm×180mm。
2.7 旋渦混合器。
2.8 無菌平皿:宜徑90mm。
2.9 恒溫水浴箱:46℃士1℃。
2.10 顯微鏡:10倍-100倍。
2.11微量移液器及槍頭:1.OmL。
2.12 折光儀
2.13 郝氏計測玻片:具有標準計測室的特製玻片。
2.14 出蓋玻片。
2.15 測微器:具標準刻度的玻片。
3 培養基和試劑
3.1 生理鹽水:見A.1。
3.2 馬鈴薯葡萄糖瓊脂：見A.2。
3.3 孟加拉紅瓊脂:見A.3。
3.4 磷酸鹽緩衝液:見A.4。
第一法 黴菌和酵母平板計數法
4 檢驗程序
黴菌和酵母平板計數窪的檢驗程序見圖1。
5 操作步驟
5.1樣品的稀釋
5.1.1 固體和半固體樣品:稱取25 g樣品,加人225 mL無菌稀釋液(蒸餾水或生理鹽水或磷酸鹽緩衝液),充分振搖,或用拍擊式均質器拍打1 min-2 m心製成1 : 10的樣品勻液。
5.1.2 液體樣晶:以無菌吸管吸取25 mL樣晶至盛有225 mL無茵稀釋液(蒸餾水或生理鹽水或磷酸鹽緩衝液)的適宜容器內(可在瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)或無菌均質袋中,充分振搖或用拍擊式均質器拍打1 min-2 min,製成1-10的樣品勻液。
5.1.3 取1 mLl: 10樣晶勻液注人含有9mL無菌稀釋液的試管中,另換一支1mL無菌吸管反複吹吸,或在旋渦混合器上混勻,此液為1 : 100的樣品勻液。
5.1.4接5.1.3操作,製備10倍遞增係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次,換用1支1 mL無菌吸管。
5.1.5 根據對樣品汙染狀況的估計,選擇2個一3個適宜稀釋度的樣晶勻液(液體樣品可包括原液),在進行10倍遞增稀釋的同時,每個稀釋度分別吸取1 mL樣晶勻液於2個無菌平皿內。同時分別取1 mL無菌稀釋液加人2個無菌平皿作空自對照。
5.1.6 及時將20 mL-25 mL冷卻至46 ℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂或孟加拉紅瓊脂(可放置於46 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫)傾汪平皿.並轉動平皿使其混合均勻。置水平台麵待蠟養基完全凝固。
5.2 培養
瓊脂凝固後,正置平板,置28 ℃±1 ℃培養箱中培養,觀察並記錄培養至第5 d的結果。
5.3 苗落計敬
用肉眼觀察,必要時可用放大鏡或低倍鏡,記錄稀釋倍數和相應的黴菌和酵母菌落數。以菌落形成單位(coiony-formingunits,CFU)表示。
選取菌落數在10 CFU-150 CFU的平板,根據菌落形態分別計數黴茵和酵母。黴菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為菌落蔓延。
6 結果與報告
6.1 結果
6.1.1 計算同一稀釋度的兩個平板茵落數的平均值,再將平均值乘以相應稀釋倍數。
6.1.2 若有兩個稀釋度平板上菌落數均在10 CFU-150 CFU之間,則按照GB 4789.2的相應規定進行計算。
6.1.3 若所有平板上菌落數均大於150 CFU,則對稀釋度最高的平板迸行計數,其他平板可記錄為多不可計,結果接平均菌落數乘以最離稀釋倍數計算。
6.1.4 若所有平板上菌落數均小於10 CFU,則應接稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
6.1.5 若所有稀釋度(包括液體樣晶原液)平板均無菌落生長,則以小於1乘以最低稀釋倍數計算。
6.1.6 若所有稀釋度的平板菌落數均不在10 CFU-150 CFU之間.其中一部分小於10 CFU或大於150 CFU時,則以最接近10 CFU或1ap CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
6.2 報告
6.2.1菌落數接“四舍五入”原則修約。菌落數在10以內時,采用一位有效數字報告;菌落數在10-100之間時,采用兩位有效數字報告。
6.2.2 菌落數大於或等於100時,前第3位數字采用“四舍五入”原則修約後,取前2位數字,後麵用0代替位數來表示結果;也可用10的指數形式來表示,此時也接“四舍五人”原則修約,采用兩位有效數字。
6.2.3 若空自對照平板上有菌落出現,則此次檢測結果無效
6.2.4 稱重取樣以CFU/g為單位報告,體積取樣以CFU/mL為單位報告,報告或分別報告黴菌和/或酵母數。
第二法 黴菌直接鏡檢計數法
7 操作步驟
7.1 檢樣的製備:取適量檢樣.加蒸餾水稀釋至折光指數為1.3447-1.3460(即濃度為7.9%一8.8%),備用。
7.2 顯微鏡標準視野的校正:將顯微鏡按放大率90倍一125倍調節標準視野,使其宜徑為1.382 mm。
7.3 塗片:洗淨郝氏計測玻片.將製好的標準液.用玻璃棒均勻的攤布於計測室,加益玻片,以備觀察。
7.4 觀測:將製好之載玻片置於顯微鏡標準視野下進行觀測。一般每一檢樣每人觀察50個視野。同一檢樣應由兩人進行觀察。
7.5 結果與計算:在標準視野下,發現有黴菌菌絲其長度超過標準視野(1.382 mm)的1/6或三根菌絲總長度超過標準視野的1/6(即測微器的一格)時即記錄為陽性(+),否則記錄為陰性(一)。
7.6 報告:報告每100個視野中全部陽性視野數為黴菌的視。百分數(視野%)。
附錄A
培養基和試劑
A.1 生理鹽水
A.1.1 成分
氯化鈉 8.5g
蒸餾水 1000mL
A.1.2 製法
氯化鈉加入1000 mL蒸餾水中,攪拌至完全溶解,分裝後,121 ℃滅菌15 mh,備用。
A.2 馬鈴薯葡萄搪瓊脂
A.2.1成分
馬鈴薯(去皮切塊) 300 g
葡萄糖 20.0 g
瓊脂 20.0 g
氯黴素 0.1g
蒸餾水 1000 mL
A.2.2 製法
將馬鈴薯去皮切塊,加1000mL蒸餾水,煮沸10 min-20 min。用紗布過濾.補加蒸餾水至1000 ml加入葡萄糖和瓊脂，加熱溶解，分裝後,121 ℃滅菌15 min,備用。
A.3 孟加拉紅瓊脂
A.3.1成分
蛋白腖 5.0 g
葡萄糖 10.0 g
磷酸二氫鉀 1.0 g
硫酸鎂(無水) 0.5g
瓊脂 20.0 g
孟加拉紅 0.033 g
氯黴素 0.1 g
蒸餾水 1000 mL
A.3.2 製法
上述各成分加人蒸餾水申,加熱溶解,補足燕餾水至1000 mL.分裝後.121 ℃滅菌15 min避光保存備用。
A.4 磷酸鹽緩衝液
A.4.1成分
磷酸二氫鉀 34.0 g
蒸餾水 500 mL
A.4.2 製法
貯存液:稱取34.O g的磷酸二氫鉀溶於500 mL蒸餾水中,用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液凋節pH至7.2±0.1用蒸餾水稀釋至1000 mL後貯存於冰箱。
稀釋液:取貯存液1.25 mL,用蒸餾水稀釋至1000 mL,分裝於適宜容器申,121 ℃高壓滅菌15min。
