前 言
本標準代替GB4789.4—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》、SN0170—1992《出口食品沙門氏菌屬(包括亞利桑那菌)檢驗方法》、SN/T2552.5—2010《乳及乳製品衛生微生物學檢驗方法 第5部分:沙門氏菌檢驗》。
整合後的標準與GB4789.4—2010相比,主要變化如下:
———修改了檢測流程和血清學檢測操作程序;
———修改了附錄A 和附錄B。
1 範圍
本標準規定了食品中沙門氏菌(Salmonella)的檢驗方法。
本標準適用於食品中沙門氏菌的檢驗。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
2.1 冰箱:2℃~5℃。
2.2 恒溫培養箱:36℃±1℃,42℃±1℃。
2.3 均質器。
2.4 振蕩器。
2.5 電子天平:感量0.1g。
2.6 無菌錐形瓶:容量500mL,250mL。
2.7 無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。
2.8 無菌培養皿:直徑60mm,90mm。
2.9 無菌試管:3mm×50mm、10mm×75mm。
2.10 pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙。
2.11 全自動微生物生化鑒定係統。
2.12 無菌毛細管。
3 培養基和試劑
3.1 緩衝蛋白腖水(BPW):見A.1。
3.2 四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液:見A.2。
3.3 亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液:見A.3。
3.4 亞硫酸鉍(BS)瓊脂:見A.4。
3.5 HE瓊脂:見A.5。
3.6 木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂:見A.6。
3.7 沙門氏菌屬顯色培養基。
3.8 三糖鐵(TSI)瓊脂:見A.7。
3.9 蛋白腖水、靛基質試劑:見A.8。
3.10 尿素瓊脂(pH7.2):見A.9。
3.11 氰化鉀(KCN)培養基:見A.10。
3.12 賴氨酸脫羧酶試驗培養基:見A.11。
3.13 糖發酵管:見A.12。
3.14 鄰硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培養基:見A.13。
3.15 半固體瓊脂:見A.14。
3.16 丙二酸鈉培養基:見A.15。
3.17 沙門氏菌O、H 和Vi診斷血清。
3.18 生化鑒定試劑盒。
4 檢驗程序
沙門氏菌檢驗程序見圖1。
5 操作步驟
5.1 預增菌
無菌操作稱取25g(mL)樣品,置於盛有225mLBPW 的無菌均質杯或合適容器內,以8000r/min~10000r/min均質1min~2min,或置於盛有225mLBPW 的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min~2min。若樣品為液態,不需要均質,振蕩混勻。如需調整pH,用1mol/mL 無菌NaOH 或HCl調pH 至6.8±0.2。無菌操作將樣品轉至500mL錐形瓶或其他合適容器內(如均質杯本身具有無孔蓋,可不轉移樣品),如使用均質袋,可直接進行培養,於36℃±1℃培養8h~18h。如為冷凍產品,應在45℃以下不超過15min,或2℃~5℃不超過18h解凍。
5.2 增菌
輕輕搖動培養過的樣品混合物,移取1mL,轉種於10mLTTB內,於42℃±1℃培養18h~24h。同時,另取1mL,轉種於10mLSC內,於36℃±1℃培養18h~24h。
5.3 分離
分別用直徑3mm的接種環取增菌液1環,劃線接種於一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板(或HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養基平板),於36℃±1℃分別培養40h~48h(BS瓊脂平板)或18h~24h(XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養基平板),觀察各個平板上生長的菌落,各個平板上的菌落特征見表1。
5.4 生化試驗
5.4.1 自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落,接種三糖鐵瓊脂,先在斜麵劃線,再於底層穿刺;接種針不要滅菌,直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養基和營養瓊脂平板,於36 ℃±1 ℃培養18h~24h,必要時可延長至48h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養基內,沙門氏菌屬的反應結果見表2。
5.4.2 接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養基的同時,可直接接種蛋白腖水(供做靛基質試驗)、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養基,也可在初步判斷結果後從營養瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。於36℃±1℃培養18h~24h,必要時可延長至48h,按表3判定結果。將已挑菌落的平板儲存於2℃~5℃或室溫至少保留24h,以備必要時複查。
5.4.2.1 反應序號A1:典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN 和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常,按表4可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌。
5.4.2.2 反應序號A2:補做甘露醇和山梨醇試驗,沙門氏菌靛基質陽性變體兩項試驗結果均為陽性,但需要結合血清學鑒定結果進行判定。
5.4.2.3 反應序號A3:補做ONPG。ONPG 陰性為沙門氏菌,同時賴氨酸脫羧酶陽性,甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。
5.4.2.4 必要時按表5進行沙門氏菌生化群的鑒別。
5.4.3 如選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定係統,可根據5.4.1的初步判斷結果,從營養瓊脂平板上挑取可疑菌落,用生理鹽水製備成濁度適當的菌懸液,使用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定係統進行鑒定。
5.5 血清學鑒定
5.5.1 檢查培養物有無自凝性
一般采用1.2%~1.5%瓊脂培養物作為玻片凝集試驗用的抗原。首先排除自凝集反應,在潔淨的玻片上滴加一滴生理鹽水,將待試培養物混合於生理鹽水滴內,使成為均一性的混濁懸液,將玻片輕輕搖動30s~60s,在黑色背景下觀察反應(必要時用放大鏡觀察),若出現可見的菌體凝集,即認為有自凝性,反之無自凝性。對無自凝的培養物參照下麵方法進行血清學鑒定。
5.5.2 多價菌體抗原(O)鑒定
在玻片上劃出2個約1cm×2cm 的區域,挑取1環待測菌,各放1/2環於玻片上的每一區域上部,在其中一個區域下部加1滴多價菌體(O)抗血清,在另一區域下部加入1滴生理鹽水,作為對照。再用無菌的接種環或針分別將兩個區域內的菌苔研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1min,並對著黑暗背景進行觀察,任何程度的凝集現象皆為陽性反應。O 血清不凝集時,將菌株接種在瓊脂量較高的(如
2%~3%)培養基上再檢查;如果是由於Vi抗原的存在而阻止了O 凝集反應時,可挑取菌苔於1mL生理鹽水中做成濃菌液,於酒精燈火焰上煮沸後再檢查。
5.5.3 多價鞭毛抗原(H)鑒定
操作同5.5.2。H 抗原發育不良時,將菌株接種在0.55%~0.65%半固體瓊脂平板的中央,待菌落蔓延生長時,在其邊緣部分取菌檢查;或將菌株通過接種裝有0.3%~0.4%半固體瓊脂的小玻管1次~2次,自遠端取菌培養後再檢查。
5.6 血清學分型(選做項目)
5.6.1 O 抗原的鑒定
用A~F多價O 血清做玻片凝集試驗,同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙型菌株,不能分型。
被A~F多價O 血清凝集者,依次用O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2和O11因子血清做凝集試驗。
根據試驗結果,判定O 群。被O3、O10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19單因子血清做凝集試驗,判定E1、E4各亞群,每一個O 抗原成分的最後確定均應根據O 單因子血清的檢查結果,沒有O單因子血清的要用兩個O 複合因子血清進行核對。
不被A~F多價O 血清凝集者,先用9種多價O 血清檢查,如有其中一種血清凝集,則用這種血清所包括的O 群血清逐一檢查,以確定O 群。每種多價O 血清所包括的O 因子如下:
O 多價1 A,B,C,D,E,F群(並包括6,14群)
O 多價2 13,16,17,18,21群
O 多價3 28,30,35,38,39群
O 多價4 40,41,42,43群
O 多價5 44,45,47,48群
O 多價6 50,51,52,53群
O 多價7 55,56,57,58群
O 多價8 59,60,61,62群
O 多價9 63,65,66,67群
5.6.2 H 抗原的鑒定
屬於A~F各O 群的常見菌型,依次用表6所述H 因子血清檢查第1相和第2相的H 抗原。
不常見的菌型,先用8種多價H 血清檢查,如有其中一種或兩種血清凝集,則再用這一種或兩種血清所包括的各種H 因子血清逐一檢查,以第1相和第2項的H 抗原。8種多價H 血清所包括的H 因子如下:
H 多價1 a,b,c,d,i
H 多價2 eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51
H 多價3 k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40
H 多價4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6
H 多價5 z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38
H 多價6 z39,z41,z42,z44
H 多價7 z52,z53,z54,z55
H 多價8 z56,z57,z60,z61,z62
每一個H 抗原成分的最後確定均應根據H 單因子血清的檢查結果,沒有H 單因子血清的要用兩個H 複合因子血清進行核對。
檢出第1相H 抗原而未檢出第2相H 抗原的或檢出第2相H 抗原而未檢出第1相H 抗原的,可在瓊脂斜麵上移種1代~2代後再檢查。如仍隻檢出一個相的H 抗原,要用位相變異的方法檢查其另一個相。單相菌不必做位相變異檢查。
位相變異試驗方法如下:
簡易平板法:將0.35%~0.4%半固體瓊脂平板烘幹表麵水分,挑取因子血清1環,滴在半固體平板表麵,放置片刻,待血清吸收到瓊脂內,在血清部位的中央點種待檢菌株,培養後,在形成蔓延生長的菌苔邊緣取菌檢查。
小玻管法:將半固體管(每管約1mL~2mL)在酒精燈上溶化並冷至50℃,取已知相的H 因子血清0.05mL~0.1mL,加入於溶化的半固體內,混勻後,用毛細吸管吸取分裝於供位相變異試驗的小玻管內,待凝固後,用接種針挑取待檢菌,接種於一端。將小玻管平放在平皿內,並在其旁放一團濕棉花,以防瓊脂中水分蒸發而幹縮,每天檢查結果,待另一相細菌解離後,可以從另一端挑取細菌進行檢查。
培養基內血清的濃度應有適當的比例,過高時細菌不能生長,過低時同一相細菌的動力不能抑製。一般按原血清1∶200~1∶800的量加入。
小倒管法:將兩端開口的小玻管(下端開口要留一個缺口,不要平齊)放在半固體管內,小玻管的上端應高出於培養基的表麵,滅菌後備用。臨用時在酒精燈上加熱溶化,冷至50℃,挑取因子血清1環,加入小套管中的半固體內,略加攪動,使其混勻,待凝固後,將待檢菌株接種於小套管中的半固體表層內,每天檢查結果,待另一相細菌解離後,可從套管外的半固體表麵取菌檢查,或轉種1%軟瓊脂斜麵,於36℃培養後再做凝集試驗。
5.6.3 Vi抗原的鑒定
用Vi因子血清檢查。已知具有Vi抗原的菌型有:傷寒沙門氏菌,丙型副傷寒沙門氏菌,都柏林沙門氏菌。
5.6.4 菌型的判定
根據血清學分型鑒定的結果,按照附錄B或有關沙門氏菌屬抗原表判定菌型。
6 結果與報告
綜合以上生化試驗和血清學鑒定的結果,報告25g(mL)樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。
附 錄 A
培養基和試劑
A.1 緩衝蛋白腖水(BPW)
A.1.1 成分
蛋白腖 10.0g
氯化鈉5.0g
磷酸氫二鈉(含12個結晶水) 9.0g
磷酸二氫鉀1.5g
蒸餾水1000mL
A.1.2 製法
將各成分加入蒸餾水中,攪混均勻,靜置約10min,煮沸溶解,調節pH 至7.2±0.2,高壓滅菌121℃,15min。
A.2 四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液
A.2.1 基礎液
蛋白腖 10.0g
牛肉膏5.0g
氯化鈉3.0g
碳酸鈣45.0g
蒸餾水1000mL
除碳酸鈣外,將各成分加入蒸餾水中,煮沸溶解,再加入碳酸鈣,調節pH 至7.0±0.2,高壓滅菌121℃,20min。
A.2.2 硫代硫酸鈉溶液
硫代硫酸鈉(含5個結晶水) 50.0g
蒸餾水加至100mL
高壓滅菌121℃,20min。
A.2.3 碘溶液
碘 片20.0g
碘化鉀25.0g
蒸餾水加至100mL
將碘化鉀充分溶解於少量的蒸餾水中,再投入碘片,振搖玻瓶至碘片全部溶解為止,然後加蒸餾水至規定的總量,貯存於棕色瓶內,塞緊瓶蓋備用。
A.2.4 0.5%煌綠水溶液
煌綠0.5g
蒸餾水100mL
溶解後,存放暗處,不少於1d,使其自然滅菌。
A.2.5 牛膽鹽溶液
牛膽鹽 10.0g
蒸餾水100mL
加熱煮沸至完全溶解,高壓滅菌121℃,20min。
A.2.6 製法
基礎液 900mL
硫代硫酸鈉溶液100mL
碘溶液20.0mL
煌綠水溶液2.0mL
牛膽鹽溶液50.0mL
臨用前,按上列順序,以無菌操作依次加入基礎液中,每加入一種成分,均應搖勻後再加入另一種成分。
A.3 亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液
A.3.1 成分
蛋白腖 5.0g
乳糖4.0g
磷酸氫二鈉10.0g
亞硒酸氫鈉4.0g
L-胱氨酸0.01g
蒸餾水1000mL
A.3.2 製法
除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸外,將各成分加入蒸餾水中,煮沸溶解,冷至55℃以下,以無菌操作加入亞硒酸氫鈉和1g/LL-胱氨酸溶液10mL(稱取0.1gL-胱氨酸,加1mol/L氫氧化鈉溶液15mL,使溶解,再加無菌蒸餾水至100mL即成,如為DL-胱氨酸,用量應加倍)。搖勻,調節pH 至7.0±0.2。
A.4 亞硫酸鉍(BS)瓊脂
A.4.1 成分
蛋白腖 10.0g
牛肉膏5.0g
葡萄糖5.0g
硫酸亞鐵0.3g
磷酸氫二鈉4.0g
煌綠0.025g或5.0g/L水溶液5.0mL
檸檬酸鉍銨2.0g
亞硫酸鈉6.0g
瓊脂18.0g~20.0g
蒸餾水1000mL
A.4.2 製法
將前三種成分加入300mL蒸餾水(製作基礎液),硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉分別加入20mL和30mL蒸餾水中,檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉分別加入另一20mL和30mL蒸餾水中,瓊脂加入600mL蒸餾水中。然後分別攪拌均勻,煮沸溶解。冷至80℃左右時,先將硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉混勻,倒入基礎液中,混勻。
將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉混勻,倒入基礎液中,再混勻。調節pH 至7.5±0.2,隨即傾入瓊脂液中,混合均勻,冷至50℃~55℃。加入煌綠溶液,充分混勻後立即傾注平皿。
注:本培養基不需要高壓滅菌,在製備過程中不宜過分加熱,避免降低其選擇性,貯於室溫暗處,超過48h會降低其選擇性,本培養基宜於當天製備,第二天使用。
A.5 HE 瓊脂(HektoenEntericAgar)
A.5.1 成分
蛋白腖 12.0g
牛肉膏3.0g
乳糖12.0g
蔗糖12.0g
水楊素2.0g
膽鹽20.0g
氯化鈉5.0g
瓊脂18.0g~20.0g
蒸餾水1000mL
0.4%溴麝香草酚藍溶液16.0mL
Andrade指示劑20.0mL
甲液20.0mL
乙液20.0mL
A.5.2 製法
將前麵七種成分溶解於400mL蒸餾水內作為基礎液;將瓊脂加入於600mL蒸餾水內。然後分別攪拌均勻,煮沸溶解。加入甲液和乙液於基礎液內,調節pH 至7.5±0.2。再加入指示劑,並與瓊脂液合並,待冷至50℃~55℃傾注平皿。
注:①本培養基不需要高壓滅菌,在製備過程中不宜過分加熱,避免降低其選擇性。
②甲液的配製
硫代硫酸鈉 34.0g
檸檬酸鐵銨4.0g
蒸餾水100mL
③乙液的配製
去氧膽酸鈉 10.0g
蒸餾水100mL
④Andrade 指示劑
酸性複紅 0.5g
1mol/L氫氧化鈉溶液16.0mL
蒸餾水100mL
將複紅溶解於蒸餾水中,加入氫氧化鈉溶液。數小時後如複紅褪色不全,再加氫氧化鈉溶液1mL~2mL。
A.6 木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂
A.6.1 成分
酵母膏 3.0g
L-賴氨酸5.0g
木糖3.75g
乳糖7.5g
蔗糖7.5g
去氧膽酸鈉2.5g
檸檬酸鐵銨0.8g
硫代硫酸鈉6.8g
氯化鈉5.0g
瓊脂15.0g
酚紅0.08g
蒸餾水1000mL
A.6.2 製法
除酚紅和瓊脂外,將其他成分加入400mL蒸餾水中,煮沸溶解,調節pH 至7.4±0.2。另將瓊脂加入600mL蒸餾水中,煮沸溶解。
將上述兩溶液混合均勻後,再加入指示劑,待冷至50℃~55℃傾注平皿。
注:本培養基不需要高壓滅菌,在製備過程中不宜過分加熱,避免降低其選擇性,貯於室溫暗處。本培養基宜於當天製備,第二天使用。
A.7 三糖鐵(TSI)瓊脂
A.7.1 成分
蛋白腖 20.0g
牛肉膏5.0g
乳糖10.0g
蔗糖10.0g
葡萄糖1.0g
硫酸亞鐵銨(含6個結晶水) 0.2g
酚紅0.025g或5.0g/L溶液5.0mL
氯化鈉5.0g
硫代硫酸鈉0.2g
瓊脂12.0g
蒸餾水1000mL
GB4789.4—2016
1 2
A.7.2 製法
除酚紅和瓊脂外,將其他成分加入400mL蒸餾水中,煮沸溶解,調節pH 至7.4±0.2。另將瓊脂加入600mL蒸餾水中,煮沸溶解。
將上述兩溶液混合均勻後,再加入指示劑,混勻,分裝試管,每管約2mL~4mL,高壓滅菌121 ℃10min或115℃15min,滅菌後製成高層斜麵,呈桔紅色。
A.8 蛋白腖水、靛基質試劑
A.8.1 蛋白腖水
蛋白腖(或胰蛋白腖) 20.0g
氯化鈉5.0g
蒸餾水1000mL
將上述成分加入蒸餾水中,煮沸溶解,調節pH 至7.4±0.2,分裝小試管,121℃高壓滅菌15min。
A.8.2 靛基質試劑
A.8.2.1 柯凡克試劑:將5g對二甲氨基甲醛溶解於75mL戊醇中,然後緩慢加入濃鹽酸25mL。
A.8.2.2 歐-波試劑:將1g對二甲氨基苯甲醛溶解於95 mL95% 乙醇內。然後緩慢加入濃鹽酸20mL。
A.8.3 試驗方法
挑取小量培養物接種,在36℃±1℃培養1d~2d,必要時可培養4d~5d。加入柯凡克試劑約0.5mL,輕搖試管,陽性者於試劑層呈深紅色;或加入歐-波試劑約0.5mL,沿管壁流下,覆蓋於培養液表麵,陽性者於液麵接觸處呈玫瑰紅色。
注:蛋白腖中應含有豐富的色氯酸。每批蛋白腖買來後,應先用已知菌種鑒定後方可使用。
A.9 尿素瓊脂(pH7.2)
A.9.1 成分
蛋白腖 1.0g
氯化鈉5.0g
葡萄糖1.0g
磷酸二氫鉀2.0g
0.4%酚紅3.0mL
瓊脂20.0g
蒸餾水1000mL
20%尿素溶液100mL
A.9.2 製法
除尿素、瓊脂和酚紅外,將其他成分加入400mL蒸餾水中,煮沸溶解,調節pH 至7.2±0.2。另將瓊脂加入600mL蒸餾水中,煮沸溶解。
將上述兩溶液混合均勻後,再加入指示劑後分裝,121 ℃高壓滅菌15min。冷至50 ℃~55 ℃,加入經除菌過濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為2%。分裝於無菌試管內,放成斜麵備用。
A.9.3 試驗方法
挑取瓊脂培養物接種,在36℃±1℃培養24h,觀察結果。尿素酶陽性者由於產堿而使培養基變為紅色。
A.10 氰化鉀(KCN)培養基
A.10.1 成分
蛋白腖 10.0g
氯化鈉5.0g
磷酸二氫鉀0.225g
磷酸氫二鈉5.64g
蒸餾水1000mL
0.5%氰化鉀20.0mL
A.10.2 製法
將除氰化鉀以外的成分加入蒸餾水中,煮沸溶解,分裝後121 ℃高壓滅菌15min。放在冰箱內使其充分冷卻。每100mL培養基加入0.5%氰化鉀溶液2.0mL(最後濃度為1∶10000),分裝於無菌試管內,每管約4mL,立刻用無菌橡皮塞塞緊,放在4℃冰箱內,至少可保存兩個月。同時,將不加氰化鉀的培養基作為對照培養基,分裝試管備用。
A.10.3 試驗方法
將瓊脂培養物接種於蛋白腖水內成為稀釋菌液,挑取1環接種於氰化鉀(KCN)培養基。並另挑取1環接種於對照培養基。在36℃±1℃培養1d~2d,觀察結果。如有細菌生長即為陽性(不抑製),經2d細菌不生長為陰性(抑製)。
注:氰化鉀是劇毒藥,使用時應小心,切勿沾染,以免中毒。夏天分裝培養基應在冰箱內進行。試驗失敗的主要原因是封口不嚴,氰化鉀逐漸分解,產生氫氰酸氣體逸出,以致藥物濃度降低,細菌生長,因而造成假陽性反應。試驗時對每一環節都要特別注意。
A.11 賴氨酸脫羧酶試驗培養基
A.11.1 成分
蛋白腖 5.0g
酵母浸膏3.0g
葡萄糖1.0g
蒸餾水1000mL
1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1.0mL
L-賴氨酸或DL-賴氨酸0.5g/100mL或1.0g/100mL
A.11.2 製法
除賴氨酸以外的成分加熱溶解後,分裝每瓶100mL,分別加入賴氨酸。L-賴氨酸按0.5%加入,DL-賴氨酸按1%加入。調節pH 至6.8±0.2。對照培養基不加賴氨酸。分裝於無菌的小試管內,每管0.5mL,上麵滴加一層液體石蠟,115℃高壓滅菌10min。
A.11.3 試驗方法
從瓊脂斜麵上挑取培養物接種,於36℃±1 ℃培養18h~24h,觀察結果。氨基酸脫羧酶陽性者由於產堿,培養基應呈紫色。陰性者無堿性產物,但因葡萄糖產酸而使培養基變為黃色。對照管應為黃色。
A.12 糖發酵管
A.12.1 成分
牛肉膏 5.0g
蛋白腖10.0g
氯化鈉3.0g
磷酸氫二鈉(含12個結晶水) 2.0g
0.2%溴麝香草酚藍溶液12.0mL
蒸餾水1000mL
A.12.2 製法
A.12.2.1 葡萄糖發酵管按上述成分配好後,調節pH 至7.4±0.2。按0.5%加入葡萄糖,分裝於有一個倒置小管的小試管內,121℃高壓滅菌15min。
A.12.2.2 其他各種糖發酵管可按上述成分配好後,分裝每瓶100mL,121℃高壓滅菌15min。另將各種糖類分別配好10%溶液,同時高壓滅菌。將5mL糖溶液加入於100mL培養基內,以無菌操作分裝小試管。
注:蔗糖不純,加熱後會自行水解者,應采用過濾法除菌。
A.12.3 試驗方法
從瓊脂斜麵上挑取小量培養物接種,於36℃±1℃培養,一般2d~3d。遲緩反應需觀察14d~30d。
A.13 鄰硝基酚β-D 半乳糖苷(ONPG)培養基
A.13.1 成分
鄰硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)
(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)
60.0mg
0.01mol/L磷酸鈉緩衝液(pH7.5) 10.0mL
1%蛋白腖水(pH7.5) 30.0mL
A.13.2 製法
將ONPG溶於緩衝液內,加入蛋白腖水,以過濾法除菌,分裝於無菌的小試管內,每管0.5mL,用橡皮塞塞緊。
A.13.3 試驗方法
自瓊脂斜麵上挑取培養物1滿環接種於36℃±1℃培養1h~3h和24h觀察結果。如果β-半乳糖苷酶產生,則於1h~3h變黃色,如無此酶則24h不變色。
A.14 半固體瓊脂
A.14.1 成分
牛肉膏 0.3g
蛋白腖1.0g
氯化鈉0.5g
瓊脂0.35g~0.4g
蒸餾水100mL
A.14.2 製法
按以上成分配好,煮沸溶解,調節pH 至7.4±0.2。分裝小試管。121℃高壓滅菌15min。直立凝固備用。
注:供動力觀察、菌種保存、H 抗原位相變異試驗等用。
A.15 丙二酸鈉培養基
A.15.1 成分
酵母浸膏 1.0g
硫酸銨2.0g
磷酸氫二鉀0.6g
磷酸二氫鉀0.4g
氯化鈉2.0g
丙二酸鈉3.0g
0.2%溴麝香草酚藍溶液12.0mL
蒸餾水1000mL
A.15.2 製法
除指示劑以外的成分溶解於水,調節pH 至6.8±0.2,再加入指示劑,分裝試管,121 ℃高壓滅菌15min。
A.15.3 試驗方法
用新鮮的瓊脂培養物接種,於36℃±1℃培養48h,觀察結果。陽性者由綠色變為藍色。
附 錄 B
常見沙門氏菌抗原
常見沙門氏菌抗原見表B.1。
