前 言
本標準代替GB4789.2—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。
1 範圍
本標準規定了食品中菌落總數(Aerobicplatecount)的測定方法。
本標準適用於食品中菌落總數的測定。
2 術語和定義
菌落總數 aerobicplatecount
食品檢樣經過處理,在一定條件下(如培養基、培養溫度和培養時間等)培養後,所得每g(mL)檢樣中形成的微生物菌落總數。
3 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
3.1 恒溫培養箱:36℃±1℃,30℃±1℃。
3.2 冰箱:2℃~5℃。
3.3 恒溫水浴箱:46℃±1℃。
3.4 天平:感量為0.1g。
3.5 均質器。
3.6 振蕩器。
3.7 無菌吸管:1mL(具0.01mL 刻度)、10mL(具0.1mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
3.8 無菌錐形瓶:容量250mL、500mL。
3.9 無菌培養皿:直徑90mm。
3.10 pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙。
3.11 放大鏡或/和菌落計數器。
4 培養基和試劑
4.1 平板計數瓊脂培養基:見A.1。
4.2 磷酸鹽緩衝液:見A.2。
4.3 無菌生理鹽水:見A.3。
5 檢驗程序
菌落總數的檢驗程序見圖1。
6 操作步驟
6.1 樣品的稀釋
6.1.1 固體和半固體樣品:稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質杯內,8000-10000r/min均質1min~2min,或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min~2min,製成1∶10的樣品勻液。
6.1.2 液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)中,充分混勻,製成1∶10的樣品勻液。
6.1.3 用1mL 無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注於盛有9mL稀釋液的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液麵),振搖試管或換用1支無菌吸管反複吹打使其混合均勻,製成1∶100的樣品勻液。
6.1.4 按6.1.3操作,製備10 倍係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次,換用1 次1mL 無菌吸管或吸頭。
6.1.5 根據對樣品汙染狀況的估計,選擇2個~3個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),在進行10倍遞增稀釋時,吸取1mL樣品勻液於無菌平皿內,每個稀釋度做兩個平皿。同時,分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。
6.1.6 及時將15mL~20mL冷卻至46℃的平板計數瓊脂培養基(可放置於46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿,並轉動平皿使其混合均勻。
6.2 培養
6.2.1 待瓊脂凝固後,將平板翻轉,36℃±1培養48h±2h。水產品30℃±1℃培養72h±3h。
6.2.2 如果樣品中可能含有在瓊脂培養基表麵彌漫生長的菌落時,可在凝固後的瓊脂表麵覆蓋一薄層瓊脂培養基(約4mL),凝固後翻轉平板,按6.2.1條件進行培養。
6.3 菌落計數
6.3.1 可用肉眼觀察,必要時用放大鏡或菌落計數器,記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位(colony-formingunits,CFU)表示。
6.3.2 選取菌落數在30CFU~300CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低於30CFU的平板記錄具體菌落數,大於300CFU 的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。
6.3.3 其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數;若片狀菌落不到平板的一半,而其餘一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個平板後乘以
2,代表一個平板菌落數。
6.3.4 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時,則將每條單鏈作為一個菌落計數。
7 結果與報告
7.1 菌落總數的計算方法
7.1.1 若隻有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數範圍內,計算兩個平板菌落數的平均值,再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每g(mL)樣品中菌落總數結果。
7.1.2 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數範圍內時,按式(1)計算:
N = ∑C/(n1 +0.1n2)d ……………………(1)
式中:
N ———樣品中菌落數;
∑C———平板(含適宜範圍菌落數的平板)菌落數之和;
n1 ———第一稀釋度(低稀釋倍數)平板個數;
n2 ———第二稀釋度(高稀釋倍數)平板個數;
d ———稀釋因子(第一稀釋度)。
示例:
N = ∑C/(n1 +0.1n2)d = (232+244+33+35)/[2+ (0.1×2)]×10-2 = 544/0.022=24727
上述數據按7.2.2數字修約後,表示為25000或2.5×104。
7.1.3 若所有稀釋度的平板上菌落數均大於300CFU,則對稀釋度最高的平板進行計數,其他平板可記錄為多不可計,結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。
7.1.4 若所有稀釋度的平板菌落數均小於30CFU,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
7.1.5 若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小於1乘以最低稀釋倍數計算。
7.1.6 若所有稀釋度的平板菌落數均不在30CFU~300CFU 之間,其中一部分小於30CFU 或大於300CFU 時,則以最接近30CFU 或300CFU 的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
7.2 菌落總數的報告
7.2.1 菌落數小於100CFU 時,按“四舍五入”原則修約,以整數報告。
7.2.2 菌落數大於或等於100CFU 時,第3位數字采用“四舍五入”原則修約後,取前2位數字,後麵用0代替位數;也可用10的指數形式來表示,按“四舍五入”原則修約後,采用兩位有效數字。
7.2.3 若所有平板上為蔓延菌落而無法計數,則報告菌落蔓延。
7.2.4 若空白對照上有菌落生長,則此次檢測結果無效。
7.2.5 稱重取樣以CFU/g為單位報告,體積取樣以CFU/mL為單位報告。
附 錄 A
培養基和試劑
A.1 平板計數瓊脂(platecountagar,PCA)培養基
A.1.1 成分
胰蛋白腖 5.0g
酵母浸膏 2.5g
葡萄糖 1.0g
瓊脂 15.0g
蒸餾水 1000mL
A.1.2 製法
將上述成分加於蒸餾水中,煮沸溶解,調節pH 至7.0±0.2。分裝試管或錐形瓶,121 ℃高壓滅菌15min。
A.2 磷酸鹽緩衝液
A.2.1 成分
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 34.0g
蒸餾水 500mL
A.2.2 製法
貯存液:稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶於500mL蒸餾水中,用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH 至7.2,用蒸餾水稀釋至1000mL後貯存於冰箱。稀釋液:取貯存液1.25 mL,用蒸餾水稀釋至1000 mL,分裝於適宜容器中,121 ℃ 高壓滅菌15min。
A.3 無菌生理鹽水
A.3.1 成分
氯化鈉 8.5g
蒸餾水 1000mL
A.3.2 製法
稱取8.5g氯化鈉溶於1000mL蒸餾水中,121℃高壓滅菌15min。
