細菌分解乳糖依靠兩種酶的作用，一種是β-半乳糖苷酶滲透酶，它位於細胞膜上，可送乳糖分子滲入細胞，另一種β-半乳糖苷酶，亦稱乳糖酶，位於細胞內，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。
具有上述兩種酶的細菌，能在24-48h發酵乳糖，而缺乏此兩種酶的細菌，不能分解乳糖。乳糖遲緩發酵菌隻有β-半乳糖苷酶（胞內酶）而缺乏β-半乳糖苷滲透酶，因而乳糖進入細胞很慢，需經培養基中1%乳糖較長時間的誘導，產生相當數量的滲透酶後，才能較快分解乳糖，故呈現遲緩發酵現象。
ONPG可迅速進入細菌細胞，被β-半乳糖苷酶水解，釋放出黃色的鄰位硝基苯酚（ONP），故而培養基變黃可迅速測知β-半乳糖苷酶的存在。當細菌為遲緩發酵乳糖時，其分解乳糖的時間非常長，常需連續監測3-7天；而培養基中加入ONPG後，遲緩發酵乳糖的細菌也可在非常短的時間內監測到，常在2-16h內可以得到陽性結果。
因此，用含有ONPG的培養基可以快速鑒定乳糖遲緩發酵菌。
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