1 範圍
本標準規定了食品用雙歧杆菌（Bifidobacterium）的鑒定及計數方法。
本標準適用於食品用雙歧杆菌純菌菌種的鑒定及計數。本標準適用於食品中僅含有單一的雙歧杆菌菌種的鑒定；以及食品中僅含有雙歧杆菌屬的計數，雙歧杆菌屬可包含一種或多種不同的雙歧杆菌菌種。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
2.1 恒溫培養箱：36 ℃±1 ℃。
2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.3 天平：感量0.1 g。
2.4 無菌試管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
2.5 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及配套吸頭。
2.6 無菌培養皿：直徑90 mm。
3 培養基和試劑
3.1 雙歧杆菌培養基：見附錄A.1。
3.2 PYG培養基：見附錄A.2。
3.3 甲醇：分析純。
3.4 三氯甲烷：分析純。
3.5 冰乙酸：分析純。
3.6 乳酸：分析純。
3.7 乙酸標準溶液：吸取分析純冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，標定方法見附錄B.1，此溶液濃度約為1 mol/L。
3.8 乳酸標準溶液：吸取分析純乳酸8.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，標定方法見附錄B.1，此溶液濃度約為1 mol/L。
4 檢驗程序
雙歧杆菌的檢驗程序見圖1。
圖1 雙歧杆菌的檢驗程序
5 操作步驟
5.1 無菌要求：全部操作均應遵循無菌操作程序。
5.2 食品用雙歧杆菌純菌菌種的鑒定及計數
5.2.1 鑒定
5.2.1.1 接種：半固體或液體菌種直接接種在雙歧杆菌瓊脂平板。真空冷凍幹燥菌種，先加適量滅菌生理鹽水，溶解菌粉，然後接種在雙歧杆菌瓊脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厭氧培養48 h±2 h。
5.2.1.2 塗片鏡檢：雙歧杆菌為革蘭氏染色陽性，不抗酸、無芽孢、無動力，菌體形態多樣，呈短杆狀、纖細杆狀或球形，可形成各種分支或分叉形態。
5.2.1.3 生化鑒定：挑取5.2.1.1步驟中的平板上生長的單個菌落，進行生化反應檢測。雙歧杆菌的過氧化氫酶試驗為陰性。不同雙歧杆菌菌種的主要生化反應見表1。
5.2.1.4 氣相色譜法測定雙歧杆菌的有機酸代謝產物（可選項），見附錄B.1。
5.2.2 計數
5.2.2.1 樣品的稀釋
5.2.2.2.1 取1.0 g固體菌種溶解於9.0 mL生理鹽水或其它稀釋液，製成1:10的樣品勻液。
5.2.2.2.2 用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1.0 mL，沿管壁緩慢注於裝有9.0 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無菌吸管反複吹打使其混合均勻，製成1:100的樣品勻液。
5.2.2.2.3 另取1 mL無菌吸管或吸頭，按5.2.2.2.1操作程序，製備10倍係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，即換用1次1 mL滅菌吸管或吸頭。
5.2.2.2.4 根據對樣品雙歧杆菌濃度的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液，在進行10倍遞增稀釋時，吸取1.0 mL樣品勻液於無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1.0 mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。
5.2.2.2.5 及時將 15 mL～20 mL冷卻至 46 ℃的雙歧杆菌瓊脂培養基（可放置於46 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，並轉動平皿使其混合均勻。
5.2.2.2 培養
待瓊脂凝固後，將平板翻轉，36 ℃±1 ℃厭氧培養48 h±2 h。
5.2.2.3 菌落計數
可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落
形成單位（colony-forming units，CFU）表示。
5.2.2.3.1 選取菌落數在30 CFU～300 CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低於30 CFU的平板記錄具體菌落數，大於300 CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。
5.2.2.3.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其餘一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板後乘以2，代表一個平板菌落數。
5.2.2.3.3 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。
5.3 食品中雙歧杆菌的鑒定及計數
5.3.1 鑒定
5.3.1.1 稱重取樣25.0 g，或體積取樣25.0 mL，置於裝有225 mL稀釋液的滅菌錐形瓶內，製成1:10的樣品勻液。
5.3.1.2 將上述樣品勻液接種在雙歧杆菌瓊脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厭氧培養48 h±2 h。
5.3.1.3 純培養
挑取3個或以上的單個菌落接種於雙歧杆菌瓊脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厭氧培養48 h±2 h。
5.3.1.4 塗片鏡檢：參照5.2.1.2。
5.3.1.5 生化鑒定：參照5.2.1.3。
5.3.1.6 氣相色譜法測定雙歧杆菌的有機酸代謝產物，參照5.2.1.4。
5.3.2 計數
5.3.2.1 同5.3.1.1步。
5.3.2.2 稀釋步驟 參照5.2.2.1。
5.3.2.3 菌落計數 參照5.2.2.3。
6 報告
6.1 鑒定
根據5.2.1.2項鏡檢、5.2.1.3項生化鑒定，報告雙歧杆菌屬的種名。根據5.2.1.4項乙酸與乳酸微摩爾之比，報告雙歧杆菌的有機酸代謝產物。
6.2 計數
6.2.1 菌落計數的計算方法和報告：參照GB 4789.2《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》中的7.1和7.2。
6.2.2 稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。
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