1 範圍
本標準規定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的檢驗方法。
本標準適用於含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗。
2 規範性引用文件
本標準中引用的文件對於本標準的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用於本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本標準。
3 術語和定義
3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria
一類可發酵糖主要產生大量乳酸的細菌的通稱。本標準中乳酸菌主要為乳杆菌屬（Lactobacillus）、雙歧杆菌屬（Bifidobacterium）和鏈球菌屬（Streptococcus）。
4 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
4.1 恒溫培養箱：36 ℃±1 ℃。
4.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
4.3 均質器及無菌均質袋、均質杯或滅菌乳缽。
4.4 天平：感量0.1 g。
4.5 無菌試管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
4.6 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸頭。
4.7 無菌錐形瓶：500 mL、250 mL。
5 培養基和試劑
5.1 MRS（Man Rogosa Sharpe）培養基及莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）改良MRS培養基：見附錄A中A.1。
5.2 MC培養基（Modified Chalmers 培養基）：見附錄A中A.2。
5.3 0.5%蔗糖發酵管:見附錄A中A.3。
5.4 0.5%纖維二糖發酵管:見附錄A中A.3。
5.5 0.5%麥芽糖發酵管:見附錄A中A.3。
5.6 0.5%甘露醇發酵管:見附錄A中A.3。
5.7 0.5%水楊苷發酵管:見附錄A中A.3。
5.8 0.5%山梨醇發酵管:見附錄A中A.3。
5.9 0.5%乳糖發酵管:見附錄A中A.3。
5.10 七葉苷發酵管:見附錄A中A.4
5.11 革蘭氏染色液：見附錄A中A.5。
5.12 莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）：化學純。
5.13 半胱氨酸鹽酸鹽（Cysteine Hydrochloride）：純度＞99%。
6 檢驗程序
乳酸菌檢驗程序見圖1。
7 操作步驟
7.1樣品製備
7.1.1 樣品的全部製備過程均應遵循無菌操作程序。
7.1.2 冷凍樣品可先使其在2 ℃～5 ℃條件下解凍，時間不超過18 h，也可在溫度不超過45 ℃的條件解凍，時間不超過15 min。
7.1.3 固體和半固體食品：以無菌操作稱取25 g樣品，置於裝有225 mL生理鹽水的無菌均質杯內，於8000 r/min～10000 r/min均質1 min～2 min，製成1:10樣品勻液；或置於225 mL生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min～2 min製成1:10的樣品勻液。
7.1.4 液體樣品：液體樣品應先將其充分搖勻後以無菌吸管吸取樣品25 mL放入裝有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分振搖，製成1:10的樣品勻液。
7.2 步驟
7.2.1 用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注於裝有9 mL生理鹽水的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無菌吸管反複吹打使其混合均勻，製成1:100的樣品勻液。
7.2.2 另取1 mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1 mL滅菌吸管或吸頭。
7.2.3 乳酸菌計數
7.2.3.1 乳酸菌總數
根據待檢樣品活菌總數的估計，選擇2個～3個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液於滅菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿後，將冷卻至50℃的MRS瓊脂培養基傾注入平皿約15mL，轉動平皿使混合均勻。36℃±1℃厭氧培養48 h±2 h，培養後計數。從樣品稀釋到平板傾注要求在15min內完成。
7.2.3.2 雙歧杆菌計數
根據對待檢樣品雙歧杆菌含量的估計，選擇2個～3個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液於滅菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿後，將冷卻至50℃的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽的MRS培養基傾注入平皿約15mL，轉動平皿使混合均。36℃±1℃厭氧培養48 h±2 h，培養後計數平板上的所有菌落數。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內完成。
7.2.3.3 嗜熱鏈球菌計數
根據待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數的估計，選擇2個～3個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液於滅菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿後，將冷卻至50℃的MC培養基傾注入平皿約15mL，轉動平皿使混合均勻。36℃±1℃需氧培養48 h±2 h，培養後計數。嗜熱鏈球菌在MC瓊脂平板上的菌落特征為：菌落中等偏小，邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑2 mm±1 mm， 菌落背麵為粉紅色。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內完成。
7.2.3.4 乳杆菌計數
7.2.3.1 項乳酸菌總數結果減去7.2.3.2 項雙歧杆菌與7.2.3.3 項嗜熱鏈球菌計數結果之和即得乳杆菌計數。
7.3 菌落計數
可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。
7.3.1 選取菌落數在30 CFU～300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低於30 CFU的平板記錄具體菌落數，大於300 CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。
7.3.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其餘一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板後乘以2，代表一個平板菌落數。
7.3.3 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。
7.4 結果的表述
7.4.1 若隻有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數範圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每g（mL）中菌落總數結果。
7.4.2 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數範圍內時，按公式（1）計算：
式中：
N——樣品中菌落數；
∑C——平板（含適宜範圍菌落數的平板）菌落數之和；
n1——第一稀釋度（低稀釋倍數）平板個數；
n2——第二稀釋度（高稀釋倍數）平板個數；
d——稀釋因子（第一稀釋度）。
7.4.3 若所有稀釋度的平板上菌落數均大於300 CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。
7.4.4 若所有稀釋度的平板菌落數均小於30 CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
7.4.5 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小於1乘以最低稀釋倍數計算。
7.4.6 若所有稀釋度的平板菌落數均不在30 CFU～300 CFU之間，其中一部分小於30 CFU或大於300 CFU時，則以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
7.5 菌落數的報告
7.5.1 菌落數小於100 CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數報告。
7.5.2 菌落數大於或等於100 CFU時，第3位數字采用“四舍五入”原則修約後，取前2位數字，後麵用0代替位數；也可用10的指數形式來表示，按“四舍五入”原則修約後，采用兩位有效數字。
7.5.3 稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。
8 結果與報告
根據菌落計數結果出具報告，報告單位以CFU/g（mL）表示。
9 乳酸菌的鑒定（可選做）
9.1 純培養
挑取3個或以上單個菌落，嗜熱鏈球菌接種於MC瓊脂平板，乳杆菌屬接種於MRS瓊脂平板，置36 ℃±1 ℃厭氧培養48 h。
9.2 鑒定
9.2.1 雙歧杆菌的鑒定按GB 4789.34的規定操作。
9.2.2 塗片鏡檢：乳杆菌屬菌體形態多樣，呈長杆狀、彎曲杆狀或短杆狀。無芽胞，革蘭氏染色陽性。嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球杆狀，直徑為0.5 μm～2.0 μm，成對或成鏈排列，無芽胞，革蘭氏染色陽性。
9.2.3 乳酸菌菌種主要生化反應見表1和表2。
附 錄 A
培養基及試劑
A.1 MRS培養基
A.1.1 成分
|
蛋白腖 |
10.0 g |
|
牛肉粉 |
5.0 g |
|
酵母粉 |
4.0 g |
|
葡萄糖 |
20.0 g |
|
吐溫80 |
1.0 mL |
|
K2HPO4·7H2O |
2.0 g |
|
醋酸鈉·3H2O |
5.0 g |
|
檸檬酸三銨 |
2.0 g |
|
MgSO4·7H2O |
0.2 g |
|
MnSO4·4H2O |
0.05 g |
|
瓊脂粉 pH 6.2 |
15.0 g |
A.1.2 製法
將上述成分加入到1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，調節pH，分裝後121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。
A.1.3 莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS培養基
A.1.3.1 莫匹羅星鋰鹽儲備液製備：稱取50mg莫匹羅星鋰鹽加入到50 mL蒸餾水中，用0.22 mm微孔濾膜過濾除菌。
A.1.3.2 半胱氨酸鹽酸鹽儲備液製備：稱取250mg莫匹羅星鋰鹽加入到50 mL蒸餾水中，用0.22 mm微孔濾膜過濾除菌。
A.1.3.2 製法
將A.1.1 成分加入到950 mL蒸餾水中，加熱溶解，調節pH，分裝後121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。臨用時加熱熔化瓊脂，在水浴中冷至48 ℃，用帶有0.22 mm微孔濾膜的注射器將莫匹羅星鋰鹽儲備液及半胱氨酸鹽酸鹽儲備液製備加入到熔化瓊脂中，使培養基中莫匹羅星鋰鹽的濃度為50 mg/mL，半胱氨酸鹽酸鹽的濃度為500 mg/mL。
A.2 MC培養基
A.2.1 成分
|
大豆蛋白腖 |
5.0 g |
|
牛肉粉 |
3.0 g |
|
酵母粉 |
3.0 g |
|
葡萄糖 |
20.0 g |
|
乳糖 |
20.0 g |
|
碳酸鈣 |
10.0 g |
|
瓊脂 |
15.0 g |
|
蒸餾水 |
1 000 mL |
|
1％中性紅溶液 pH6.0 |
5.0 mL |
A.2.2 製法
將前麵7種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調節pH，加入中性紅溶液。分裝後121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。
A.3 乳酸杆菌糖發酵管
A.3.1 基礎成分
|
牛肉膏 |
5.0 g |
|
蛋白腖 |
5.0 g |
|
酵母浸膏 |
5.0 g |
|
吐溫80 |
0.5 mL |
|
瓊脂 |
1.5 g |
|
1.6%溴甲酚紫酒精溶液 |
1.4 mL |
|
蒸餾水 |
1 000 mL |
A.3.2 製法
按0.5%加入所需糖類，並分裝小試管,121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。
A.4七葉苷培養基
|
A.4.1 成分 |
|
|
蛋白腖 |
5.0 g |
|
磷酸氫二鉀 |
1.0 g |
|
七葉苷 |
3.0 g |
|
枸櫞酸鐵 |
0.5 g |
|
1.6%溴甲酚紫酒精溶液 |
1.4 mL |
|
蒸餾水 |
100 mL |
|
A.4.2 製法 將上述成分加入蒸餾水中，加熱溶解，121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。 |
|
A.5革蘭氏染色液
A.5.1 結晶紫染色液
A.5.1.1 成分
|
結晶紫 |
1.0 g |
|
95％乙醇 |
20 mL |
|
1％草酸銨水溶液 |
80 mL |
A.5.1.2 製法
將結晶紫完全溶解於乙醇中，然後與草酸銨溶液混合。
A.5.2 革蘭氏碘液
A.5.2.1 成分
|
碘 |
1.0 g |
|
碘化鉀 |
2.0 g |
|
蒸餾水 |
300 mL |
A.5.2.2 製法
將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解後，再加蒸餾水至300 mL。
A.5.3 沙黃複染液
A.5.3.1 成分
|
沙黃 |
0.25 g |
|
95％乙醇 |
10 mL |
|
蒸餾水 |
90 mL |
A.5.3.2 製法
將沙黃溶解於乙醇中，然後用蒸餾水稀釋。
A.5.4 染色法
A.5.4.1 將塗片在酒精燈火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染1 min，水洗。
A.5.4.2 滴加革蘭氏碘液，作用1 min，水洗。
A.5.4.3 滴加95％乙醇脫色，約15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。
A.5.4.4 滴加複染液，複染1 min。水洗、待幹、鏡檢。
下一篇：流感病毒檢測方法大匯總
