附錄B
五種致瀉大腸埃希氏菌PCR鑒定方法
B.1 試劑和材料
B.1.1 按照表B.1序列在基因合成公司合成引物。
B.1.2 1µL取菌環。
B.1.3 滅菌去離子水。
B.1.4 0.85%滅菌生理鹽水。
B.1.5 10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA， pH8.0 TE溶液：量取1 mol/L Tris-HCl緩衝液（pH8.0）5 mL、0.5 mol/L EDTA溶液（pH8.0）1 mL於500 mL燒杯中。加入約400 mL去離子水均勻混合，將溶液定容至500 mL，121 ℃高壓滅菌15 min，室溫保存。
B.1.6 1.5 mL Eppendorf管，8聯排管和8聯排蓋（平蓋/凸蓋）。
B.1.7 10×PCR反應緩衝液，含840 mmoL Tris-HCl (pH 8.5)和500 mmoL KCl。
B.1.8 25 mmol/L MgCl2。
B.1.9 2.5 mmol/L dNTPs：dATP、dTTP、dGTP、dCTP每種濃度為2.5 mmol/L。
B.1.10 5 U/µL Taq酶。
B.1.11 陽性對照品：包含12對引物擴增的目標DNA序列或者含有目標基因的標準菌株。
B.1.12 50×TAE電泳緩衝液：稱量242 g Tris-HCl 和 37.2 g Na2EDTA·2H2O於1 L燒杯中，加入約800mL去離子水，充分攪拌均勻；加入57.1 mL的冰乙酸，充分溶解；用NaOH調pH至8.3，加去離子水定容至1 L後，室溫保存。使用時稀釋50倍即為1×TAE電泳緩衝液。
B.1.13 瓊脂糖。
B.1.14 溴化乙錠（EB）或其他核酸染料。
B.1.15 6×上樣緩衝液。
B.1.16 分子量Marker：至少包含100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp條帶。
B.1.17 微量移液器及對應吸頭：0.5µL～2µL，2µL ～20µL，20µL ～200µL，200µL～1000µL。
B.2 儀器和設備
B.2.1 低溫冷凍離心機：控溫4℃～8℃，最大轉速不小於13000 rpm。
B.2.2 PCR儀。
B.2.3 天平：感量0.01g。
B.2.4 核酸電泳儀，包括電源、電泳槽、製膠槽（長度>10cm）和梳子。
B.2.5 凝膠成像係統或紫外成像儀。
B.2.6 微量加樣器：0.5µL～2µL，2µL～20µL，20µL～200µL，200µL～1000µL。
B.3 檢測步驟
B.3.1 DNA模板準備
B.3.1.1 將平板或斜麵上生長的菌落懸浮於200 µL 0.85%滅菌生理鹽水中，充分打散形成菌懸液，13000 rpm離心3 min。
B.3.1.2 棄掉上清液，使用1 mL滅菌去離子水充分混勻菌體，於100 °C水浴或者金屬浴維持10 min。
B.3.1.3 冰浴冷卻後，13000 rpm離心3 min，收集上清液，用滅菌去離子水按1:10稀釋上清液，取2 µL作為PCR檢測的模板。
B.3.1.4 也可用細菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，按照細菌基因組提取試劑盒說明書進行操作；所有處理後的DNA模板在-20°C以下保存備用。
B.3.2 PCR對照
每次PCR反應使用EPEC、EIEC、ETEC、STEC/EHEC、EAEC標準菌株或陽性對照品作為陽性對照。同時，使用大腸埃希氏菌ATCC 25922作為陰性對照，使用滅菌去離子水作為空白對照，控製PCR體係汙染。
B.3.3 PCR反應體係配製及擴增
每個樣品初篩需配置12個PCR擴增反應體係，對應檢測12個目標基因，具體操作如下：
B.3.3.1 使用TE溶液（pH8.0）將合成的引物幹粉稀釋成100 µmol/L儲存液。
B.3.3.2 根據表B.1中每種目標基因對應PCR體係內引物的終濃度，使用滅菌去離子水配製12種目標基因擴增所需的10×引物工作液（以uidA基因為例，如表B.2）。
表B.1 五種致瀉大腸埃希氏菌目標基因引物序列及每個PCR體係內的終濃度
|
引物名稱 |
引物序列c |
終濃度n（µmol/L） |
PCR產物長度(bp) |
|
uidA–F |
5′-ATG CCA GTC CAG CGT TTT TGC-3′ |
0.2 |
1487 |
|
uidA–R |
5′-AAA GTG TGG GTC AAT AAT CAG GAA GTG-3′ |
0.2 |
|
|
escV–F |
5′-ATT CTG GCT CTC TTC TTC TTT ATG GCT G-3′ |
0.4 |
544 |
|
escV–R |
5′-CGT CCC CTT TTA CAA ACT TCA TCG C-3′ |
0.4 |
|
|
eae-Fa |
5′-ATT ACC ATC CAC ACA GAC GGT-3′ |
0.2 |
397 |
|
eae-Ra |
5′-ACA GCG TGG TTG GAT CAA CCT-3′ |
0.2 |
|
|
bfpB–F |
5′-GAC ACC TCA TTG CTG AAG TCG-3′ |
0.1 |
910 |
|
bfpB–R |
5′-CCA GAA CAC CTC CGT TAT GC-3′ |
0.1 |
|
|
stx1–F |
5′-CGA TGT TAC GGT TTG TTA CTG TGA CAG C-3′ |
0.2 |
244 |
|
stx1–R |
5′-AAT GCC ACG CTT CCC AGA ATT G-3′ |
0.2 |
|
|
stx2–F |
5′-GTT TTG ACC ATC TTC GTC TGA TTA TTG AG-3′ |
0.4 |
324 |
|
stx2–R |
5′-AGC GTA AGG CTT CTG CTG TGA C-3′ |
0.4 |
|
|
lt–F |
5′-GAA CAG GAG GTT TCT GCG TTA GGT G-3′ |
0.1 |
655 |
|
lt–R |
5′-CTT TCA ATG GCT TTT TTT TGG GAG TC-3′ |
0.1 |
|
|
stp–F |
5′-CCT CTT TTA GYC AGA CAR CTG AAT CAS TTG-3′ |
0.4 |
157 |
|
stp–R |
5′-CAG GCA GGA TTA CAA CAA AGT TCA CAG-3′ |
0.4 |
|
|
sth–F |
5′-TGT CTT TTT CAC CTT TCG CTC-3′ |
0.2 |
171 |
|
sth–R |
5′-CGG TAC AAG CAG GAT TAC AAC AC-3′ |
0.2 |
|
|
invE–F |
5′-CGA TAG ATG GCG AGA AAT TAT ATC CCG-3′ |
0.2 |
766 |
|
invE–R |
5′-CGA TCA AGA ATC CCT AAC AGA AGA ATC AC-3′ |
0.2 |
|
|
ipaH-Fb |
5′-TTG ACC GCC TTT CCG ATA CC-3′ |
0.1 |
647 |
|
ipaH-Rb |
5′-ATC CGC ATC ACC GCT CAG AC-3′ |
0.1 |
|
|
aggR–F |
5′-ACG CAG AGT TGC CTG ATA AAG-3′ |
0.2 |
400 |
|
aggR–R |
5′-AAT ACA GAA TCG TCA GCA TCA GC-3′ |
0.2 |
|
|
pic–F |
5′-AGC CGT TTC CGC AGA AGC C-3′ |
0.2 |
1111 |
|
pic–R |
5′-AAA TGT CAG TGA ACC GAC GAT TGG-3′ |
0.2 |
|
|
astA–F |
5′-TGC CAT CAA CAC AGT ATA TCC G-3′ |
0.4 |
102 |
|
astA–R |
5′-ACG GCT TTG TAG TCC TTC CAT-3′ |
0.4 |
|
|
16S rDNA-F |
5′-GGA GGC AGC AGT GGG AAT A-3′ |
0.25 |
1062 |
|
16S rDNA-R |
5′-TGA CGG GCG GTG TGT ACA AG-3′ |
0.25 |
注： a：escV和eae基因選作其中一個；b：invE和ipaH基因選作其中一個；c：表中不同基因的引物序列可采用可靠性驗證的其他序列代替。
表B.2 每種目標基因擴增所需10×引物工作液配製表
|
引物名稱 |
體積（µL） |
|
100 µmol/L uidA–F |
10×n |
|
100 µmol/L uidA–R |
10×n |
|
滅菌去離子水 |
100 - 2×（10×n） |
|
總體積 |
100 |
注： n：每條引物在反應體係內的終濃度（詳見表B.1）。
B.3.3.3 將10×引物工作液、10×PCR反應緩衝液、25 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、滅菌去離子水從-20℃冰箱中取出，融化並平衡至室溫，使用前混勻；5 U/µL Taq酶在加樣前從-20℃冰箱中取出。
B.3.3.4 每個樣品按照表B.3的加液量配製12個25 µL反應體係，分別使用12種目標基因對應10×引物工作液。
表B.3 五種致瀉大腸埃希氏菌目標基因擴增體係配製表
|
試劑名稱 |
加樣體積（µL） |
|
滅菌去離子水 |
12.1 |
|
10×PCR 反應緩衝液 |
2.5 |
|
25 mmol/L MgCl2 |
2.5 |
|
2.5 mmol/L dNTPs |
3.0 |
|
10×引物工作液 |
2.5 |
|
5 U/µL Taq酶 |
0.4 |
|
DNA模板 |
2.0 |
|
總體積 |
25 |
B.3.3.5 按照如下反應條件設置PCR儀：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，複性63 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1.5 min，30個循環；最後72 ℃延伸5 min。
B.3.3.6 將配製完成的PCR反應管放入PCR儀中，核查PCR反應條件正確後，啟動反應程序。
B.3.4瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物
B.3.4.1 稱量4 g瓊脂糖粉，加入至200 mL的1×TAE電泳緩衝液中，充分混勻。使用微波爐反複加熱至沸騰，直到瓊脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。
B.3.4.2 待瓊脂糖溶液冷卻至60 ℃左右時，加入溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5 µg/mL，充分混勻後，輕輕倒入已放置好梳子的模具中，凝膠的長度要大於10 cm，適宜厚度為3 mm～5 mm。檢查梳齒下或梳齒間有無氣泡，用一次性吸頭小心排掉瓊脂糖凝膠中的氣泡。
B.3.4.3 當瓊脂糖凝膠完全凝結硬化後，輕輕拔出梳子，小心將膠塊和膠床放入電泳槽中，樣品孔在陰極端。
B.3.4.4 向電泳槽中加入1×TAE電泳緩衝液，液麵高於膠麵1 mm~2 mm 。
B.3.4.5 將5 µL PCR產物與1 µL 6×上樣緩衝液混勻後，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液麵下膠孔中，小心上樣於孔中；陽性對照的PCR反應產物加入到最後一個泳道；第一個泳道中加入2 µL分子量Marker 。
B.3.4.6 接通電泳儀電源，根據公式：電壓=電泳槽正負極間的距離（cm）×5 V/cm計算並設定電泳儀電壓數值；啟動電壓開關，電泳開始以正負極鉑金絲出現氣泡為準。
B.3.4.7 電泳30 min～45 min後，切斷電源。取出凝膠放入凝膠成像係統或紫外成像儀中觀察結果，拍照並記錄數據。
B.3.5 結果判定
B.3.5.1 電泳結果中空白對照無條帶出現，陰性對照僅有uidA條帶擴增，陽性對照中出現所有目標條帶，PCR檢測結果成立。
B.3.5.2 根據電泳圖中目標條帶大小，判斷目標條帶的種類，記錄每個泳道中目標條帶的種類。
B.3.5.3 在表B.4中查找不同目標條帶種類及組合所對應的致瀉大腸埃希氏菌類別。
表B.5 五種致瀉大腸埃希氏菌目標條帶與型別對照表
|
致病型別 |
目標條帶的種類組合 |
|
|
EAEC |
aggR（+） |
uidAc（+/-）
|
|
EPEC |
bfpB（+/-）, escVa（+）, stx1（-）, stx2（-） |
|
|
STEC/EHEC |
escV a（+/-）, stx1（+）, stx2（-）, bfpB（-） escV a（+/-）stx1（-）, stx2（+）, bfpB（-） escV a（+/-）, stx1（+）, stx2（+）, bfpB（-） |
|
|
ETEC |
lt, stp, sth中一條或一條以上陽性 |
|
|
EIEC |
invEb（+） |
|
注：a：在判定EPEC或SETC/EHEC時，escV與eae基因等同效果；b：在判定EIEC時，invE與iapH基因等同效果。c：uidA+：97%以上大腸埃希氏菌為陽性。
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