1 範圍
本標準規定了食品中致瀉大腸埃希氏菌(diarrheagenic Escherichia coli)的檢驗方法。
本標準適用於食品中致瀉大腸埃希氏菌的檢驗。
2 術語和定義、縮略語
2.1 術語和定義
下列術語和定義適用於本文件。
2.1.1 致瀉大腸埃希氏菌 Diarrheagenic Escherichia coli
一類能引起人體以腹瀉症狀為主的大腸埃希氏菌，可經過汙染食物引起人類發病。常見的致瀉大腸埃希氏菌主要包括腸道致病性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌、產腸毒素大腸埃希氏菌、產誌賀毒素大腸埃希氏菌（包括腸道出血性大腸埃希氏菌）和腸道集聚性大腸埃希氏菌。
2.1.2 腸道致病性大腸埃希氏菌 Enteropathogenic Escherichia coli
能夠引起宿主腸粘膜上皮細胞黏附及擦拭性損傷，且不產生誌賀毒素的大腸埃希氏菌。它是發展中國家嬰幼兒腹瀉的主要病原菌，有高度傳染性，嚴重者可致死。EPEC的致病機製包括局限性粘附、信號傳導和緊密粘附。其中，局限性粘附由存在於EAF質粒上的束狀菌毛基因bfp介導，位於LEE毒力島上的III型分泌係統編碼基因esc參與信號傳導，引起微絨毛結構消失；而緊密粘附由外膜蛋白緊密素介導，緊密素由eae基因編碼。
2.1.3 腸道侵襲性大腸埃希氏菌 Enteroinvasive Escherichia coli
能夠侵入腸道上皮細胞而引起痢疾樣腹瀉的大腸埃希氏菌。該菌不像典型的大腸埃希氏菌，無動力、不發生賴氨酸脫羧反應、不發酵乳糖，生化反應和抗原結構均近似痢疾誌賀氏菌。侵入上皮細胞的關鍵基因是侵襲性質粒上的抗原編碼基因及其調控基因，如ipaH基因、ipaR基因（又稱為invE基因）。
2.1.4 產腸毒素大腸埃希氏菌 Enterotoxigenic Escherichia coli
能夠分泌熱穩定性腸毒素或/和熱不穩定性腸毒素的大腸埃希氏菌。熱穩定性腸毒素按照來源不同分為豬源熱穩定性腸毒素和人源熱穩定性腸毒素，編碼基因分別為stp（又稱為stIa）和sth（又稱為stIb）；熱不穩定性腸毒素編碼基因為lt。兩種腸毒素基因在產腸毒素大腸埃希氏菌中可以單獨存在，也可以同時存在。該菌可引起嬰幼兒和旅遊者腹瀉，一般呈輕度水樣腹瀉，也可呈嚴重的霍亂樣症狀，低熱或不發熱。腹瀉常為自限性，一般2～3天即自愈。
2.1.5 產誌賀毒素大腸埃希氏菌 Shiga toxin-producing Escherichia coli（腸道出血性大腸埃希氏菌 Enterohemorrhagic Escherichia coli）
能夠分泌誌賀毒素、引起宿主腸粘膜上皮細胞黏附及擦拭性損傷的大腸埃希氏菌。誌賀毒素的編碼基因為stx，誌賀毒素分為兩種類型，其編碼基因分別為stx1和stx2，相互間無免疫交叉反應。stx1和stx2 在產誌賀毒素大腸埃希氏菌中可以單獨存在，也可以同時存在。宿主腸粘膜上皮細胞黏附及擦拭性損傷表現為微絨毛結構消失和緊密粘附，分別由esc編碼的III型分泌係統和eae編碼的緊密素介導。另外，有些產誌賀毒素大腸埃希氏菌在臨床上引起人類出血性結腸炎（HC）或血性腹瀉，並可進一步發展為溶血性尿毒綜合征（HUS），這類產誌賀毒素大腸埃希氏菌為腸道出血性大腸埃希氏菌。
2.1.6 腸道集聚性大腸埃希氏菌 Enteroaggregative Escherichia coli
腸道集聚性大腸埃希氏菌不侵入腸道上皮細胞，但能引起腸道液體蓄積。不產生熱穩定性腸毒素或熱不穩定性腸毒素，也不產生誌賀毒素。唯一特征是能對Hep-2細胞形成集聚性粘附，也稱Hep-2細胞粘附性大腸埃希氏菌。
2.2 縮略語
下列縮略語適用於本文件。
2.2.1 DEC：致瀉大腸埃希氏菌 Diarrheagenic Escherichia coli
2.2.2 EPEC：腸道致病性大腸埃希氏菌 Enteropathogenic Escherichia coli
2.2.3 EIEC：腸道侵襲性大腸埃希氏菌 Enteroinvasive Escherichia coli
2.2.4 ETEC：產腸毒素大腸埃希氏菌 Enterotoxigenic Escherichia coli
2.2.5 STEC：產誌賀毒素大腸埃希氏菌 Shiga toxin-producing Escherichia coli
2.2.6 EHEC：腸道出血性大腸埃希氏菌 Enterohemorrhagic Escherichia coli
2.2.7 EAEC：腸道集聚性大腸埃希氏菌 Enteroaggregative Escherichia coli
2.2.8 escV：蛋白分泌物調節基因，gene encoding LEE-encoded type III secretion system factor
2.2.9 eae：緊密素基因，gene encoding intimin for Escherichia coli attaching and effacing
2.2.10 bfpB：束狀菌毛B基因，bundle-forming pilus B；
2.2.11 stx1：誌賀毒素Ⅰ基因，Shiga toxin one
2.2.12 stx2：誌賀毒素Ⅱ基因，Shiga toxin two
2.2.13 lt：熱不穩定性腸毒素基因，heat-labile enterotoxin
2.2.14 st：熱穩定性腸毒素基因，heat-stable enterotoxin
2.2.15 stp（stIa）：豬源熱穩定性腸毒素基因，heat-stable enterotoxins initially discovered in the isolates from pigs
2.2.16 sth（stIb）：人源熱穩定性腸毒素基因，heat-stable enterotoxins initially discovered in the isolates from human
2.2.17 invE：侵襲性質粒調節基因，invasive plasmid regulator；
2.2.18 ipaH：侵襲性質粒抗原H基因，invasive plasmid antigen H-gene；
2.2.19 aggR：集聚粘附菌毛調節基因，aggregative adhesive fimbriae regulator；
2.2.20 uidA：β-葡萄糖苷酶基因，β-glucuronidase gene；
2.2.21 astA：集聚熱穩定性毒素A基因，enteroaggregative heat-stable enterotoxin A；
2.2.22 pic：腸定植因子基因，protein involved in intestinal colonization；
2.2.23 LEE：腸細胞損傷基因座，Locus of enterocyte effacement
2.2.24 EAF：EPEC黏附因子，EPEC adhesive factor
3 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
a）恒溫培養箱： 36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃；
b）冰箱：2 ℃～5 ℃；
c）恒溫水浴箱：100℃，50℃±1 ℃；
d) 電子天平：感量0.1 g，感量0.01 g；
e）顯微鏡：10倍～100倍；
f）均質器；
g）振蕩器；
h）無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度），10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸頭；
i）無菌均質杯或無菌均質袋：容量 500 mL；
j）無菌培養皿：直徑90 mm；
k）pH計或精密pH試紙；
l）微量離心管：1.5 mL/2.0 mL；
m）低溫高速離心機；
n）全自動微生物生化鑒定係統；
o）PCR儀；
p）水平電泳儀；
q）8聯排管和8聯排蓋（平蓋/凸蓋）；
r）凝膠成像儀。
4 培養基和試劑
4.1 營養肉湯：見附錄A 中A.1。
4.2 腸道菌增菌肉湯：見附錄A 中A.2。
4.3 麥康凱瓊脂（MAC）：見附錄A 中A.3。
4.4伊紅美藍瓊脂（EMB）：見附錄A 中A.4。
4.5 三糖鐵（TSI）瓊脂：見附錄A 中A.5。
4.6 蛋白腖水、靛基質試劑：見附錄A 中A.6。
4.7 半固體瓊脂：見附錄 A 中 A.7。
4.8 尿素瓊脂（pH 7.2）：見附錄 A 中 A.8。
4.9 氰化鉀 （KCN） 培養基：見附錄 A 中 A.9。
4.10 氧化酶試劑：見附錄 A 中 A.10。
4.11 革蘭氏染色液：見附錄A中A.11。
4.12 BHI肉湯：見附錄A中A.12。
4.13 福爾馬林（含38%～40%甲醛）。
4.14 生化鑒定試劑盒。
4.15 致瀉大腸埃希氏菌PCR試劑盒。
4.16 大腸埃希氏菌診斷血清。
5 檢驗程序
致瀉大腸埃希氏菌檢驗程序見圖1。
6 操作步驟
6.1增菌
以無菌操作取檢樣25 g（或25 mL）,加入裝有滅菌225 mL營養肉湯的均質杯中，用旋轉刀片式均質器以8 000 r/min～10 000 r/min均質1 min～2 min；或加入裝有225 mL營養肉湯的均質袋中，用拍擊式均質器均質1 min～2 min。液體樣品振蕩混勻即可。於36 ℃±１℃培養6 h。取10 μL，接種於30 mL腸道菌增菌肉湯管內，於42 ℃±１℃培養18 h。
6.2 分離
將增菌液劃線接種MAC和EMB瓊脂平板，於36 ℃ ± 1 ℃培養18 h～24 h，觀察菌落特征。在MAC瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為磚紅色，不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色；在EMB瓊脂平板上，分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤，不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色。不但要挑取乳糖發酵的菌落，同時也要挑取乳糖不發酵和遲緩發酵的菌落。
6.3 生化試驗
6.3.1 選取平板上可疑菌落10個～20個（10個以下全選），分別接種TSI。同時將這些培養物分別接種蛋白腖水、尿素瓊脂（pH 7.2）和KCN肉湯。於36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。
6.3.2 TSI斜麵產酸或不產酸，底層產酸，靛基質陽性，H2S陰性和尿素酶陰性的培養物為大腸埃希氏菌。TSI底層不產酸，或H2S、KCN、尿素有任一項為陽性的培養物，均非大腸埃希氏菌。必要時做革蘭氏染色和氧化酶試驗。大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性杆菌，氧化酶陰性。
6.3.3 如選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定係統，可從營養瓊脂平板上挑取可疑菌落用0.85%滅菌生理鹽水製備成濁度適當的菌懸液，使用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定係統進行鑒定。
6.4 PCR確認試驗
6.4.1 取生化反應符合大腸埃希氏菌特征的菌落進行PCR確認試驗。
6.4.2 使用1 μL取菌環刮取營養瓊脂平板或斜麵上培養18 h～24 h的菌落，懸浮在200 μL0.85%滅菌生理鹽水中，充分打散製成菌懸液，於13000 rpm離心3 min，棄掉上清液。加入1mL滅菌去離子水充分混勻菌體，於100 °C水浴或者金屬浴維持10 min；冰浴冷卻後，13000 rpm離心3 min，收集上清液；按1:10的比例用滅菌去離子水稀釋上清液，取2 µL作為PCR檢測的模板；所有處理後的DNA模板在-20°C以下保存備用。也可用細菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，操作方法按照細菌基因組提取試劑盒說明書進行。
6.4.3 每次PCR反應使用EPEC、EIEC、STEC/ETEC、EHEC、EAEC標準菌株作為陽性對照。同時，使用大腸埃希氏菌ATCC 25922陰性對照控製PCR體係汙染。致瀉大腸埃希氏菌特征性基因見表1。
表1 五種致瀉大腸埃希氏菌特征基因
|
致瀉大腸埃希氏菌類別 |
特征性基因 |
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EPEC |
escV或eae、bfpB |
uidA |
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STEC/EHEC |
escV或eae、stx1、stx2 |
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EIEC |
invE或ipaH |
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ETEC |
lt、stp、sth |
|
|
EAEC |
astA、aggR、pic |
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6.4.4 聚合酶鏈反應（PCR）方法鑒定五種致瀉大腸埃希氏菌的操作可參考附錄B。
6.4.5 如用商品化PCR試劑盒或多重聚合酶鏈反應（MPCR）試劑盒，應按照PCR試劑盒說明書進行操作和結果判定。
6.5 血清學試驗（選做項目）
注：應按照生產商提供的使用說明進行O抗原和H抗原的鑒定。當生產商的使用說明與下麵的描述可能有偏差時，按生產商提供的使用說明進行。
6.5.1 取PCR試驗確認為致瀉大腸埃希氏菌的菌株進行血清學試驗。
6.5.2 O抗原鑒定
6.5.2.1假定試驗：挑取經生化試驗和PCR試驗證實為致瀉大腸埃希氏菌的營養瓊脂平板上的菌落，根據致瀉大腸埃希氏菌的類別，選用大腸埃希氏菌單價或多價OK血清做玻片凝集試驗。當與某一種多價OK血清凝集時，再與該多價血清所包含的單價OK血清做凝集試驗。致瀉大腸埃希氏菌所包括的O抗原群見表2。如與某一單價OK血清呈現凝集反應，即為假定試驗陽性。
6.5.2.2證實試驗：用0.85%滅菌生理鹽水製備O抗原懸液，稀釋至與Mac Farland 3號比濁管相當的濃度。原效價為1:160～1:320的O血清，用0.5%鹽水稀釋至1:40。將稀釋血清與抗原懸液於10 mm×75 mm試管內等量混合，做單管凝集試驗。混勻後放於50 ℃±1 ℃水浴箱內，經16 h後觀察結果。如出現凝集，可證實為該O抗原。
表2 致瀉大腸埃希氏菌主要的O抗原
|
DEC類別 |
DEC主要的O抗原 |
|
EPEC |
O26 O55 O86 O111ab O114 O119 O125ac O127 O128ab O142 O158等 |
|
STEC/EHEC |
O4 O26 O45 O91 O103 O104 O111 O113 O121 O128 O157 等 |
|
EIEC |
O28ac O29 O112ac O115 O124 O135 O136 O143 O144 O152 O164 O167等 |
|
ETEC |
O6 O11 O15 O20 O25 O27 O63 O78 O85 O114 O115 O26 O128ac O148 O149 O159 O166 O167等 |
|
EAEC |
O9 O62 O73 O101 O134等 |
6.5.3 H 抗原鑒定
6.5.3.1 取菌株穿刺接種半固體瓊脂管，36 ℃ ± 1 ℃培養18 h～24 h，取頂部培養物1環接種至BHI 液體培養基中，於36 ℃ ± 1 ℃培養18 h～24 h。加入福爾馬林至終濃度為0.5%，做玻片凝集或試管凝集試驗。
6.5.3.2 若待測抗原與血清均無明顯凝集，應從首次穿刺培養管中挑取培養物，再進行2～3次半固體管穿刺培養，按照6.5.3.1進行試驗。
6.6 結果報告
6.6.1根據生化試驗、PCR確認試驗的結果，報告25 g（或mL）樣品中檢出或未檢出某類致瀉大腸埃希氏菌。
6.6.2如果進行血清學試驗，根據血清學試驗的結果，報告25 g（或mL）樣品中檢出的某類致瀉大腸埃希氏菌血清型別。
附錄A
培養基和試劑
A.1 營養肉湯
A.1.1 成分
|
蛋白腖 |
10.0g |
|
牛肉膏 |
3.0g |
|
氯化鈉 |
5.0g |
|
蒸餾水 |
1000mL |
|
pH7.4±0.2 |
|
A.1.2 製法
將以上成分混合加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至7.4±0.2，分裝適當的容器。121 °C 滅菌15 min。
A.1 腸道菌增菌肉湯
A.1.1 成分
|
蛋白腖 |
10.0g |
|
葡萄糖 |
5.0g |
|
牛膽鹽 |
20.0g |
|
磷酸氫二鈉 |
8.0g |
|
磷酸二氫鉀 |
2.0g |
|
煌綠 |
0.015g |
|
蒸餾水 |
1000mL |
|
pH7.2±0.2 |
|
A.1.2 製法
將以上成分混合加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至7.2±0.2，分裝每瓶30 mL。115 °C 滅菌20 min。
A.3 麥康凱瓊脂（MAC）
A.3.1 成分
|
蛋白腖 |
20.0g |
|
乳糖 |
10.0g |
|
3號膽鹽 |
1.5g |
|
氯化鈉 |
5.0g |
|
中性紅 |
0.03g |
|
結晶紫 |
0.001g |
|
瓊脂 |
15.0g |
|
蒸餾水 |
1000mL |
pH7.2±0.2
A.3.2 製法
將以上成分混合加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至7.2±0.2，分裝。121℃高壓滅菌15min。冷卻至45 ℃～50 ℃，傾注平板。
注：如不立即使用，在2 ℃~8 ℃條件下可儲存二周。
A.4 伊紅美藍（EMB）瓊脂
A.4.1 成分
|
蛋白腖 |
10.0g |
|
乳糖 |
10.0 g |
|
磷酸氫二鉀（K2HPO4） |
2.0g |
|
瓊脂 |
15.0g |
|
2%伊紅Y水溶液 |
20.0mL |
|
0.5%美藍水溶液 |
13.0mL |
|
蒸餾水 |
1000mL |
pH7.1±0.2
A.4.2 製法
在1 000 mL蒸餾水中煮沸溶解蛋白腖、磷酸鹽和乳糖，加水補足，冷卻至25 ℃左右校正pH至7.1±0.2。再加入瓊脂， 121 ℃高壓滅菌15 min。冷至45 ℃～50 ℃，加入2％伊紅Y水溶液和0.5％美藍水溶液，搖勻，傾注平皿。
A.5 三糖鐵瓊脂（TSI）
A.5.1 成分
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蛋白腖 |
20.0 g |
|
牛肉浸膏 |
5.0 g |
|
乳糖 |
10.0g |
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蔗糖 |
10.0 g |
|
葡萄糖 |
1.0 g |
|
硫酸亞鐵銨[(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O] |
0.2 g |
|
氯化鈉 |
5.0g |
|
硫代硫酸鈉 |
0.2g |
|
酚紅 |
0.025 g |
|
瓊脂 |
12.0 g |
|
蒸餾水 |
1000mL |
pH 7.4±0.2
A.5.2 製法
除酚紅和瓊脂外，將其它成分加於400 mL水中，攪拌均勻，靜置約10 min，加熱使完全溶化， 冷卻至25 ℃左右校正pH至 7.4±0.2。另將瓊脂加於600 mL水中，靜置約10 min，加熱使完全溶化。將兩溶液混合均勻，加入5%酚紅水溶液5 mL，混勻，分裝小號試管，每管約3 mL。於121 °C 滅菌15 min，製成高層斜麵。冷卻後呈桔紅色。如不立即使用，在2 ℃ ~8 ℃條件下可儲存一個月。
A.6 蛋白腖水、靛基質試劑
A.6.1 成分
|
胰蛋白腖 |
20.0 g |
|
氯化鈉 |
5.0 g |
|
蒸餾水 |
1000mL |
pH 7.4±0.2
A.6.2 製法
將以上成分混合加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至7.4±0.2，分裝小試管，121 ℃高壓滅菌 15 min。
注：此試劑在 2 ℃~8 ℃條件下可儲存一個月。
A.6.3 靛基質試劑
A.6.3.1 柯凡克試劑：將 5 g 對二甲氨基苯甲醛溶解於 75 mL 戊醇中。然後緩慢加入濃鹽酸 25 mL。
A.6.3.2 歐－波試劑：將 1 g 對二甲氨基苯甲醛溶解於 95 mL 95%乙醇內。然後緩慢加入濃鹽酸 20 mL。
A.6.4 試驗方法
挑取少量培養物接種，在36 ℃±1 ℃培養1 d～2 d，必要時可培養4 d～5 d。加入柯凡克試劑約0.5 mL，輕搖試管，陽性者於試劑層呈深紅色；或加入歐－波試劑約 0.5 mL，沿管壁流下，覆蓋於培養液表麵，陽性者於液麵接觸處呈玫瑰紅色。
A.7 半固體瓊脂
A.7.1 成分
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蛋白腖 |
1.0 g |
|
牛肉膏 |
0.3 g |
|
氯化鈉 |
0.5 g |
|
瓊脂 |
0.3g～0.5g |
|
蒸餾水 |
100.0mL |
pH 7.4±0.2
A.7.2 製法
按以上成分配好，加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至 7.4 ± 0.2，分裝小試管。121 ℃滅菌 15 min，直立凝固備用。
A.8 尿素瓊脂（pH 7.2）
A.8.1 成分
|
蛋白腖 |
1.0 g |
|
氯化鈉 |
5.0 g |
|
葡萄糖 |
1.0 g |
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磷酸二氫鉀 |
2.0 g |
|
0.4％酚紅 |
3.0 mL |
|
瓊脂 |
20.0 g |
|
20%尿素溶液 |
100.0 mL |
|
蒸餾水 |
1 000 mL |
pH7.2±0.2
A.8.2 製法
除酚紅和尿素外的其他成分加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至7.2±0.2，加入酚紅指示劑，混勻，於121 ℃滅菌15 min。冷至約55 ℃，加入用0.22 µm過濾膜除菌後的20%尿素水溶液100 mL，混勻，以無菌操作分裝滅菌試管，每管約3 mL～4 mL，製成斜麵後放冰箱備用。
A.8.3 試驗方法
挑取瓊脂培養物接種，在 36 ℃±1 ℃培養 24 h，觀察結果。尿素酶陽性者由於產堿而使培養基變為紅色。
A.9 氰化鉀（KCN）培養基
A.9.1 成分
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蛋白腖 |
10.0 g |
|
氯化鈉 |
5.0 g |
|
磷酸二氫鉀 |
0.225 g |
|
磷酸氫二鈉 |
5.64 g |
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0.5％氰化鉀 |
20.0 mL |
|
蒸餾水 |
1 000 mL |
A.9.2 製法
將除氰化鉀以外的成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，分裝後 121 ℃高壓滅菌 15 min。放在冰箱內使其充分冷卻。每 100 mL 培養基加入 0.5％氰化鉀溶液 2.0 mL（最後濃度為 1:10 000），分裝於無菌試管內,每管約 4 mL,立刻用無菌橡皮塞塞緊,放在 4 ℃冰箱內,至少可保存兩個月。同時，將不加氰化鉀的培養基作為對照培養基,分裝試管備用。
A.9.3 試驗方法
將瓊脂培養物接種於蛋白腖水內成為稀釋菌液，挑取 1 環接種於氰化鉀（KCN）培養基。並另挑取 1 環接種於對照培養基。在 36 ℃±1 ℃培養 1 d～2 d，觀察結果。如有細菌生長即為陽性（不抑製），經 2 d 細菌不生長為陰性（抑製）。
注:氰化鉀是劇毒藥,使用時應小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培養基應在冰箱內進行。試驗失敗的主要原因是封口不嚴,氰化鉀逐漸分解，產生氫氰酸氣體逸出，以致藥物濃度降低，細菌生長，因而造成假陽性反應。試驗時對每一環節都要特別注意。
A.10 氧化酶試劑
A.10.1 成分
|
N,N’-二甲基對苯二胺鹽酸鹽或 N,N,N’,N’-四甲基對苯二胺鹽酸鹽 |
1.0 g |
|
蒸餾水 |
100mL |
A.10.2 製法
少量新鮮配製，於冰箱內避光保存，在7d內使用。
A.10.3 試驗方法
用無菌棉拭子取單個菌落，滴加氧化酶試劑，10s內呈現粉紅或紫紅色即為氧化酶試驗陽性，不變色者為氧化酶試驗陰性。
A.11 革蘭氏染色液
A.11.1結晶紫染色液
A.11.1.1成分
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結晶紫 |
1.0ｇ |
|
95％乙醇 |
20.0 mL |
|
1％草酸銨水溶液 |
80.0 mL |
A.111.2 製法
將結晶紫完全溶解於乙醇中，然後與草酸銨溶液混合。
A.11.2革蘭氏碘液
A.11.2.1成分
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碘 |
1.0ｇ |
|
碘化鉀 |
2.0ｇ |
|
蒸餾水 |
300 mL |
A.11.2.2 製法
將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解後，再加蒸餾水至300mL。
A.11.3 沙黃複染液
A.7.3.1 成分
|
沙黃 |
0.25ｇ |
|
95％乙醇 |
10mL |
|
蒸餾水 |
90mL |
A.11.3.2製法
將沙黃溶解於乙醇中，然後用蒸餾水稀釋。
A.11.4 染色法
A.11.4.1 塗片在火焰上固定，滴加結晶紫染液，染1min，水洗。
A.11.4.2 滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。
A.11.4.3 滴加95％乙醇脫色約15s～30s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。
A.11.4.4 滴加複染液，複染1min，水洗、待幹、鏡檢。
A.12 BHI肉湯
A.12.1 成分
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小牛腦浸液 |
200ｇ |
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牛心浸液 |
250ｇ |
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蛋白腖 |
10.0ｇ |
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NaCl |
5.0ｇ |
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葡萄糖 |
2.0ｇ |
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磷酸氫二鈉（Na2HPO4） |
2.5ｇ |
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蒸餾水 |
1 000 mL |
pH 7.4±0.2
A.12.2 製法
按以上成分配好，加熱溶解，冷卻至25 ℃左右校正pH至 7.4±0.2，分裝小試管。121 ℃滅菌 15 min。
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