食品微生物學檢驗 大腸菌群計數 征求意見稿

1 範圍

本標準規定了食品中大腸菌群（ Coliforms）計數的方法。

本標準適用於食品中大腸菌群的計數。

2 術語和定義

2.1 大腸菌群 coliforms 
在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞杆菌。
2.2 最可能數 most probable number，MPN

基於泊鬆分布的一種間接計數方法。

3 檢驗原理

3.1  MPN法

MPN法是統計學和微生物學結合的一種定量檢測法。待測樣品經係列稀釋並培養後，根據其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度，應用統計學概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數。

3.2 平板計數法

大腸菌群在固體培養基中發酵乳糖產酸，在指示劑的作用下形成可計數的紅色或紫色，帶有或不帶有沉澱環的菌落。
4 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
4.1 恒溫培養箱： 36 ℃ ±1 ℃。
4.2 冰箱： 2 ℃～5 ℃ 。
4.3 恒溫水浴箱： 46℃±1℃ 。
4.4 天平：感量 0.1 g。
4.5 均質器。
4.6 振蕩器。
4.7 無菌吸管： 1 mL（具 0.01 mL 刻度）、 10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。
4.8 無菌錐形瓶：容量 500 mL。
4.9 無菌培養皿：直徑 90 mm。
4.10 pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙。
4.11 菌落計數器。
5 培養基和試劑

5.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（ Lauryl Sulfate Tryptose， LST）肉湯：見附錄 A 中 A.1。
5.2 煌綠乳糖膽鹽（ Brilliant Green Lactose Bile， BGLB）肉湯：見附錄 A 中 A.2。
5.3 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（ Violet Red Bile Agar， VRBA）：見附錄 A 中 A.3。
5.4 磷酸鹽緩衝液：見附錄 A 中 A.4。
5.5 無菌生理鹽水：見附錄 A 中 A.5。
5.6 無菌 1 mol/L NaOH：見附錄 A 中 A.6。
5.7 無菌 1 mol/L HCl：見附錄 A 中 A.7。

第一法 大腸菌群 MPN 計數法

6 檢驗程序
大腸菌群MPN計數的檢驗程序見圖1 。

圖1 大腸菌群 MPN 計數法檢驗程序

7 操作步驟
7.1 樣品的稀釋
7.1.1 固體和半固體樣品：稱取 25 g 樣品,放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質杯內 ,8000 r/min～10000 r/min 均質 1 min～2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器以6次/s～9次/s拍打 1 min～2 min，製成 1:10 的樣品勻液。
7.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取 25 mL 樣品置盛有 225 mL 磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中充分振搖或置於機械振蕩器中振搖，充分混勻，製成 1:10 的樣品勻液。
7.1.3 樣品勻液的 pH 值應在 6.5～7.5 之間，必要時分別用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 調節。

7.1.4 用 1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL，沿管壁緩緩注入 9 mL 磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液麵），振搖試管或換用 1 支 1 mL 無菌吸管反複吹打，使其混合均勻，製成 1:100 的樣品勻液。
7.1.5 根據對樣品汙染狀況的估計，按上述操作，依次製成十倍遞增係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用 1 支1 mL無菌吸管或吸頭。從製備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。
7.2 初發酵試驗
每個樣品，選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3
管月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（ LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1 mL，則用雙料LST肉湯）， 36℃ ±1 ℃培養24 h±2 h，觀察倒管內是否有氣泡產生， 24 h±2 h產氣者進行複發酵試驗（證實試驗），如未產氣則繼續培養至48 h±2 h，產氣者進行複發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。
7.3 複發酵試驗（證實試驗）
用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1 環， 移種於煌綠乳糖膽鹽肉湯（ BGLB） 管中， 36 ℃ ±1℃培養48 h±2 h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。

7.4大腸菌群最可能數（MPN）的報告

按7.3確證的大腸菌群LST陽性管數，檢索MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的

MPN值。

第二法 大腸菌群平板計數法

8 檢驗程序
大腸菌群平板計數法的檢驗程序見圖2。

圖2 大腸菌群平板計數法檢驗程序

9 操作步驟

9.1 樣品的稀釋
按7.1進行。
9.2 平板計數
9.2.1 選取2個～3個適宜的連續稀釋度, 每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mL。同時取1 mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。
9.2.2 及時將15 mL～20 mL冷至46 ℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（ VRBA）約傾注於每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固後，再加3 mL～4 mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉平板，置於36 ℃ ±1 ℃培養18 h～24 h。
8.3 平板菌落數的選擇
選取菌落數在 15 CFU～150 CFU 之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落（如菌落直徑較典型菌落小）。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉澱環，菌落直徑為 0.5 mm 或更大。

9.4 證實試驗
從 VRBA 平板上挑取 10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種於 BGLB 肉湯管內， 36 ℃ ±1 ℃培養 24 h～48 h，觀察產氣情況。凡 BGLB 肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性。 
9.5 大腸菌群平板計數的報告
經最後證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以9.3中計數的平板菌落數，再乘以稀釋倍數，即為每g
（ mL）樣品中大腸菌群數。例： 10-4樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數為： 100×6/10×104/g（ mL）=6.0×105CFU/g（ mL）。

附  錄A
培養基和試劑

A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（LST）肉湯
A.1.1 成分
胰蛋白腖或胰酪腖                           20.0 g
氯化鈉                                     5.0 g
乳糖                                       5.0 g
磷酸氫二鉀（K2HPO4）                      2.75 g
磷酸二氫鉀（ KH2PO4）                     2.75 g
月桂基硫酸鈉                               0.1 g
蒸餾水                                     1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.1.2 製法
將上述成分溶解於蒸餾水中，調節 pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管 10 mL。 121 ℃高壓滅菌 15 min。
A.2 煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯
A.2.1 成分
蛋白腖                                      10.0 g
乳糖                                        10.0 g
牛膽粉（ oxgall或oxbile）溶液                200 mL
0.1%煌綠水溶液                              13.3 mL
蒸餾水                                      800 mL
pH 7.2±0.1
A.2.2 製法
將蛋白腖、乳糖溶於約500 mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200 mL（將20.0 g脫水牛膽粉溶於200 mL蒸餾水中，調節pH至7.0～7.5），用蒸餾水稀釋到975 mL，調節pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3 mL，用蒸餾水補足到1 000 mL，用棉花過濾後，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。 121 ℃高壓滅菌15 min。
A.3 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）
A.3.1 成分
蛋白腖                                     7.0 g
酵母膏                                     3.0 g
乳糖                                       10.0 g
氯化鈉                                     5.0 g
膽鹽或3號膽鹽                             1.5 g
中性紅                                     0.03 g
結晶紫                                     0.002 g
瓊脂                                       15 g～18 g
蒸餾水                                     1 000 mL
pH 7.4±0.1

A.3.2 製法
將上述成分溶於蒸餾水中，靜置幾分鍾，充分攪拌，調節pH。煮沸2 min，將培養基冷卻至45 ℃～
50 ℃傾注平板。使用前臨時製備，不得超過3 h。
A.4 磷酸鹽緩衝液
A.4.1 成分
磷酸二氫鉀（ KH2PO4）                        34.0 g
蒸餾水                                        500 mL
pH 7.2
A.4.2 製法
貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶於500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH，用蒸餾水稀釋至1 000 mL後貯存於冰箱。稀釋液：取貯存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，分裝於適宜容器中， 121 ℃高壓滅菌15 min。
A.5 無菌生理鹽水
A.5.1 成分
氯化鈉                                        8.5 g
蒸餾水                                        1000 mL
A.5.2 製法
稱取8.5ｇ氯化鈉溶於1000 mL蒸餾水中， 121 ℃高壓滅菌15 min。
A.6 1 mol/L NaOH
A.6.1 成分
NaOH                                         40.0 g
蒸餾水                                        1000 mL
A.6.2 製法
稱取40 g氫氧化鈉溶於1000 mL蒸餾水中， 121 ℃高壓滅菌15 min。
A.7 1 mol/L HCl
A.7.1 成分
HCl                                          90 mL
蒸餾水                                       1000 mL
A.7.2 製法
移取濃鹽酸90 mL，用蒸餾水稀釋至1000 mL， 121 ℃高壓滅菌15 min。

附  錄B

大腸菌群最可能數（MPN）檢索表

   B.1大腸菌群最可能數（MPN）檢索表

每g（mL）檢樣中大腸菌群最可能數（MPN）的檢索見表B.1。

表B.1  大腸菌群最可能數（MPN）檢索表

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