本法係采用酶聯免疫法測定大腸杆菌表達係統生產的重組製品中菌體蛋白質殘留量。
試劑（1)包被液（P H9.6碳酸鹽緩衝液） 稱取碳酸鈉0.32g、碳酸氫鈉0 .5 8 6 g ,置200ml量瓶中，加水溶解並稀釋至刻度。
(2 )磷酸鹽緩衝液（p H 7 . 4 )稱取氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，加水溶解並稀釋至500ml, 121°C滅菌15分鍾。
(3 )洗滌液（pH7.4) 量取聚山梨酯20 0.5ml，加磷酸鹽緩衝液至500ml。
(4 )稀釋液（p H 7 . 4 )稱取牛血清白蛋白0.5g，加洗滌液溶解並稀釋至100ml。
(5 )濃稀釋液稱取牛血清白蛋白l.O g , 加洗滌液溶解並稀釋至100ml。
(6 )底物緩衝液（pH 5 .0枸櫞酸-磷酸鹽緩衝液） 稱取磷酸氫二鈉（Na2HP04 . 12H20 )1 . 84g、枸櫞酸 0. 51g，加水溶解並稀釋至100ml。
(7 )底物液取鄰苯二胺8mg、30%過氧化氫30^1，溶於底物緩衝液20ml中。臨用時現配。
(8 )終止液lm o l/L硫酸溶液。
標準品溶液的製備 按菌體蛋白質標準品說明書加水複溶，精密量取適量，用稀釋液稀釋成每lm l中含菌體蛋白質500ng、250ng、125ng、62. 5ng、31. 25ng、15. 625ng, 7. 8125ng的溶液。
供試品溶液的製備 取供試品適量，用稀釋液稀釋成每l m l中約含2 5 0 ug 的溶液。如供試品每l m l中含量小於500ug時，用濃稀釋液稀釋1倍。
測定法 取兔抗大腸杆菌菌體蛋白質抗體適量，用包被液溶解並稀釋成每lm l中含10ug 的溶液，以100ul/ 孔加至9 6孔酶標板內，4 °C放置過夜（16~1 8小時）。用洗滌液洗板3次；用洗滌液製備1%牛血清白蛋白溶液，以200u1/孔加至酶標板內，37°C放置2 小時；將封閉好的酶標板用洗滌液洗板3 次；以100u1/孔加人標準品溶液和供試品溶液，每個稀釋度做雙孔，同時加入2 孔空白對照（稀釋液），37°C放置2 小時；用稀釋液稀釋辣根過氧化物酶（HRP)標記的兔抗大腸杆菌菌體蛋白質抗體1000倍，以100u1/ 孔加至酶標板內，37°C放置1 小時，用洗滌液洗板1 0次，以l00ul/孔加人底物液，3 7 °C避光放置4 0 分鍾，以5 0 p l /孔加入終止液終止反應。用酶標儀在波長4 9 2 n m 處測定吸光度，應用計算機分析軟件進行讀數和數據分析，也可使用手工作圖法計算。
以標準品溶液吸光度對其相應的濃度作標準曲線，並以供試品溶液吸光度在標準曲線上得到相應菌體蛋白質含量，
按以下公式計算：
供試品菌體蛋白質殘留量（％) = (c×n)/（T×106）×100
式中 c為供試品溶液中菌體蛋白質含量，ng/ml;
n為供試品稀釋倍數；
T為供試品蛋白質含量，mg/ml。
注：也可采用經驗證的酶聯免疫試劑盒進行測定。
上一篇：我國的標準、標準分類以及標準化
