一、目的要求：
了解食用菌孢子分離的方法，操作技術以及應用。
二、材料和用具
孢子收集器、75%酒精、0.25%的新潔爾滅、蘑菇、平菇子實體、接種針等。
三、方法和步驟
在無菌操作操作下使孢子在適宜的培養基上萌發，長成菌絲體而獲得純菌種的方法稱為孢子分離法。其特點是：菌絲菌齡短，因是有性繁殖產物，其菌絲生命力強。侵染病毒的菌類可用孢子分離法脫毒。在一般菌種分離中，為了避免異宗接合的菌類如香菇、平菇產生單孢子不孕現象，一般都采用多孢分離法。單孢分離法主要應用於食用菌的雜交育種。但雙孢蘑菇、草菇等同宗接合菌類可采用單孢分離法。
1．種菇的選擇
在生產中必須選擇優良品係中的優良個體作分離材料。
2．孢子采集方法
(1)孢子彈射分離法 它是利用孢子能自動彈射出子實體層的特性來收集孢子。收集有幾種不同的裝置。
①整菇插種法，需用一套孢子收集器(圖25-1)來收集孢子，將鍾罩上的孔加上棉塞或包上6~8層紗布，放在墊有4~6層紗布(浸過0.1%升汞液)的塘瓷盤上，紗布上放一培養器，內放一個不鏽鋼支架。把收集器包裝好，滅菌備用。將菌幕未破裂的成熟子實體洗幹淨，用0.1%升汞溶液或0.25%的新潔爾滅浸泡2~3min，以殺死表麵的雜菌。對於菌幕破裂、子實層已外露的子實體或無菌幕包裹的子實體，可用棉花蘸75%酒精塗擦子實體表麵消毒。按無菌操作要求移入孢子收集器，插在支架上，在適宜的溫度中培養。2~3天後孢散落在培養皿中，加入無菌水，用針筒吸取孢子液，接種在斜麵培養基中央，置於22～26℃恒溫箱中培養即可。
②鉤懸法（圖25—2），在生產上，采集木耳、銀耳孢子常用此法，傘菌也可采用此法。先將新鮮成熟的耳片用無菌水衝洗，然後用無菌紗布將水吸幹，取一小片掛在滅菌的鉤子上（傘菌則消毒後掛上），鉤子的另一端掛在三角瓶口，瓶內裝有培養基，在25℃下培養24h。孢子落到培養基上後，取出耳片，塞上棉塞繼續培養，然後再轉入試管中培養。
③貼附法，取一小塊成熟的菌褶或小塊菌蓋，用溶化的瓊脂或膠水、漿糊(需先滅菌)貼附在試管斜麵的上方或培養皿皿蓋上，經6-12h，待孢子落下後，立即將試管或培養皿中的培養基移到另一消毒過的空試管或培養皿中進行培養。
(2)菌褶上塗抹法
將傘菌手實體用75%酒精表麵消毒，按無菌操作用接種環直接插入兩片菌褶之間，輕輕地抹過褶片表麵，然後用劃線法塗抹於試管培養基上。
(3)孢子印分離法
取成熟子實體經表麵消毒後，切去菌柄，將菌褶向下放置於滅過菌的有色紙上，在20～24℃靜置一天，大量孢子落下形成孢子印，然後移少量孢子在試管培養基上培養。
(4)單孢子分離法
進行單孢子分離後，在人工控製的條件下，便兩個優良品係的單孢子進行雜交，從而培育出新品種。
①平板稀釋法，挑取少許孢子在無菌水中形成孢子懸浮液，取幾滴塗於培養基上，用無菌玻璃三角架推平。經48～72h後，鏡檢孢子萌發情況。在單個孢子旁做好標記，然後將其轉接到斜麵培養基上，待菌落長到1cm左右時進行鏡檢，觀察有無鎖狀聯合，初步確定是否是單核菌絲。
②連續稀釋法，挑取一定量孢子，經連續稀釋後，直到每滴稀釋液中隻有一個孢子，然後滴入試管中保溫培養。當發現單個菌落時，轉到新試管中繼續培養，並通過鏡檢以確定是否為單孢菌落。
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