糕點、糖果中細菌總數的測定

1、原理

菌落總數是指食品經過處理並在一定條件下培養後，所得1ml（g）檢樣中所含細菌菌落的總數。菌落總數主要作為判別食品被汙染程度的標誌，也可用以觀察細菌在食品中繁殖的動態，細菌菌落總數的測定一般用國標標準規定的平板計數法，所得結果隻包含一群能在營養瓊脂上生長的嗜中溫需氧菌的菌落總數，並不表示樣品中實際存在的所有細菌的菌落總數。由於菌落總數並不能區分細菌的種類，故常被稱為雜菌數或需氧菌數等。

食品種菌落總數越多，說明食品質量越差，病原菌汙染的可能性越大；當菌落總數僅少量存在時，病原菌汙染的可能性就會降低，或者幾乎不存在。但不能單憑菌落總數這一項指標來評定食品衛生質量的優劣，必須配合大腸菌群和病原菌項目的檢驗，才能對食品做出比較全麵準確的評價。

2、材料

1）培養基及試劑

●營養瓊脂培養基（見附錄C）

●無菌生理鹽水

●75%（體積分數）乙醇

2）器皿及其它用品

●冰箱

●恒溫培養箱

●恒溫水浴鍋

●托盤天平

●可調式電爐

●吸量管

●廣口瓶

●三角瓶

●玻璃珠（直徑為5mm）

●平皿（皿底直徑為9mm）

●試管（18mm×200mm）

●試管架

●酒精燈

●均質器或乳缽

●剪刀

●滅菌鑷子

●75%（體積分數）酒精棉球

●玻璃蠟筆

●登記本

●不鏽鋼勺等

3、菌落總數的檢驗程序見下表：

菌落總數的檢驗程序

檢樣→做成幾個適當倍數的稀釋度→選擇2~3個適宜的稀釋度，各取1ml加入滅菌平皿內→每皿內加入適量營養瓊脂→（36±1℃，48±2h）菌落計數→報告

   4、檢樣稀釋及培養

1）以無菌操作，取樣25g或25ml放入含有225ml滅菌生理鹽水的三角瓶或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨製成（1：10）的均勻稀釋液

2）用1ml無菌吸量管，吸取（1：10）稀釋液1ml，注入含有9ml生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖試管，使其混合均勻，製成（1：100）稀釋液。

3）另取1ml無菌吸量管，按上述操作順序做10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1ml無菌吸量管。

4）根據對糕點及糖果的衛生標準要求，選擇2~3個適宜稀釋度，每稀釋度吸取1ml稀釋液置於滅菌平皿內，一個稀釋度接種兩個平皿。

5）立即將預先冷卻至45℃的營養瓊脂培養基15ml傾入平皿內，並轉動平皿使其均勻。同時，將營養瓊脂培養基傾入加有1ml稀釋液的滅菌平皿內作空白對照。

6）瓊脂凝固後，翻轉平皿，置於（36±1）℃溫箱內培養（48±2）h，取出，平板內的菌落數乘以稀釋倍數，即得每克樣品（或每毫升溶液）所含菌落總數。

5、菌落計數方法

作平皿內菌落計數時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。有條件時還可用魁北克菌落計數器或菌落自動計數器。在計下各皿內菌落數後，求出同稀釋度的各皿內的平均菌落數。到達規定培養時間，應立即計數。如果不能立即計數，應將平板在0~4℃下存在，但不要超過24h。

6、菌落計數的報告

1）平皿菌落數的選擇選取菌落數在30~300個之間的平皿作為菌落總數的測定標準。一個稀釋度應采用兩個平皿內的菌落平均數，其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應采用無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的菌落數。若片狀菌落不到平皿的一半，而其餘一半中菌落分布有很均勻，則可計算半個平皿後乘2，以代表全皿菌落數。

2）稀釋度的選擇

①應選擇平均菌落數在30~300個之間的稀釋度，乘以稀釋倍數報告之。見下表例1。

②若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30~300之間，則應視兩者之比如何來決定。若其比值≤2，應報告平均數；若＞2，則報告其中較小的數字。見下表例2、例3。

③若所有稀釋度的平均菌落數均＞300，則應按稀釋倍數最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。見下表例4。

④若所有稀釋度的平均菌落數均＜30，則應按稀釋倍數最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。見下表例5。

⑤若所有稀釋度的平均菌落數均不在30~300個之間，其中一部分＞300或＜30時，則以最接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。見下表例6。

⑥若所有稀釋度均無菌落生長，則以＜1乘以最低稀釋倍數報告之。見下表例7。

3）菌落數的報告

菌落數在100以內時，按其實有數報告；＞100時，采用兩位有效數字，在兩位有效數字後麵的數值，以四舍五入方法計算。為了縮短數字後麵的零數，也可用10的指數來表示。見下表：

稀釋度選擇及菌落數報告方式

7、結果

①將試樣測出的樣品數據以報表方式報告結果。

②對樣品細菌總數做出是否符合食品衛生要求的結論。

8、注意事項

①檢驗中所需玻璃儀器必須是完全滅菌的，並在滅菌前徹底清洗幹淨，不得殘留有抑製物。用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對照。

②檢樣的稀釋液可用滅菌鹽水或蒸餾水。如果對含鹽量較高的食品（如醬品）進行稀釋，則宜采用蒸餾水。

③注意每遞增稀釋一次，必須另換一支1ml滅菌吸量管，使所得檢樣的稀釋倍數準確。

④為防止細菌增殖產生片狀菌落，在檢液加入平皿後，應在20min內傾入瓊脂，並立即使之與瓊脂混合均勻。

⑤為了控製和了解汙染，在取樣進行檢驗的同時，於工作台上打開一塊瓊脂平板，其暴露的時間應與該檢樣從製備、稀釋到加入平皿時所暴露的時間相當，然後與加有檢樣的平皿一起培養，以了解檢樣在檢驗操作過程中有無受到來自空勤的汙染。

⑥培養溫度應根據食品種類而定。

⑦加入平皿內的檢樣稀釋液（特別是10－1的稀釋液）有時帶有檢樣顆粒，為了避免與細菌菌落發生混淆，可做一檢樣稀釋液與瓊脂混合的平皿，不經培養，於4℃環境中放置，以便於在計數檢樣菌落時用作對照。

⑧檢樣若是微生物類製劑（如酸乳、乳酒），則平板計數中應相應地將有關微生物排除，不可並入檢樣的菌落總數中作報告。

⑨平板培養計數法，隻能檢出生長的活菌，不能檢出樣品中全部的細菌數，計數總是比食品中實際存在的細菌數要少。但仍能借此評定整個食品被細菌汙染的程度，一般食品的衛生檢驗中都普遍采用這種方法。

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