一、實驗目的和內容
目的：學習和掌握環狀沉澱反應及雙向瓊脂擴散沉澱反應方法。
內容：1. 用牛血清白蛋白及兔抗牛血清白蛋白，進行環狀沉澱反應。
2. 用以上抗原和抗體進行雙向瓊脂擴散沉澱反應試驗。
二、實驗材料和用具
可溶性抗原(牛血清白蛋白)、兔抗牛血清白蛋白抗血清、生理鹽水(0.85%NaCl)。
洗淨載玻片、小試管、移液管、玻璃毛細吸管、不鏽鋼吸管。
三、操作步驟
(一)環狀沉澱反應
1. 取1：25的牛血清白蛋白lmL，用生理鹽水以對倍稀釋法稀釋成1：50，1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200的抗原溶液。
2．取9支潔淨幹燥的小試管，每支小試管如入1：2的兔抗牛血清白蛋白抗血清0.5mL。
3，用移液管吸取上麵已稀釋好的牛血清白蛋白(抗原)，按表21—1要求，從最大稀釋度開始，沿著管壁徐徐加入各小試管中，使與下層抗體之間形成交界麵，切勿搖動混勻，第8管加入生理鹽水及第9管加入兔抗血清以作對照。
4．靜置15~30min，觀察在兩液麵交界處有無白色環狀沉澱物出現。
5．結果記錄 凡有白色環狀沉澱物者記“+”，沒有沉澱者記“-”。最大稀釋度的抗原與抗體交界麵之間還出現白色環狀沉澱者，此管的抗原稀釋倍數即為抗體(沉澱素)的效價。
表21-1環狀沉澱反應記錄表
(二)雙向瓊脂擴散沉澱反應
1．稱取1g優質瓊脂於l00mL pH7.2生理鹽水中，在沸水中水浴使瓊脂溶化後，加入1%的硫柳汞lmL防腐。每塊載玻片(7.5cm×4.5cm)滴加4mL瓊脂溶液，待凝固後用不鏽鋼吸管在兩端(A、B端)打梅花形小孔，孔徑和孔距均為3mm。亦可直接用不鏽鋼管打孔，再用接種針挑去梅花形孔中的瓊脂塊。
2．在A端梅花形孔中，用玻璃毛細吸管在中心孔中加入適當稀釋的抗血清(抗體)，注意要使孔加滿，但不外溢；周圍孔加入不同稀釋度的抗原(例如1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320)。
在B端梅花形孔中，同樣在中央孔中加入適當稀釋度的抗原，周圍的孔中加入不同稀釋度的抗體。
3．把以上載玻片放入帶蓋的鋁盒中，下麵墊上3一4層濕紗布，置37℃擴散24～48h，可看見抗原和抗體反應處呈現的沉澱線。
4．記錄結果 注意沉澱線數目及偏向。
四、注意事項
1．在進行環狀沉澱反應試驗時，一定要沿著管壁加入抗原，而且切勿搖動，否則影響沉澱環的形成。
2．雙向瓊脂擴散試驗時，抗原或抗體的稀釋度多少才合適，教師必須進行預測，否則由於抗原、抗體比例不合適而造成假陰性。
五、演示
1. 沿著管壁徐徐加入抗原的操作。
2. 在瓊脂板上打梅花孔的操作。
六、實驗報告
記錄環狀沉澱反應的結果並確定抗體的效價。
按照表21-2和表21-3記錄雙向瓊脂擴散結果，並分析尋找其規律性。
表21-2載玻片A端結果
七、問題和思考
1．比較凝集反應與沉澱反應有何異同？
2．雙向瓊脂擴散沉澱反應試驗中，抗原或抗體濃度大於相應抗體或抗原時，沉澱線會出現何種現象？為什麽會出現多條沉澱線？
3．如發現衣服上有一血跡，懷疑是人血，你能用簡單的方法進行鑒定嗎？並敘述其方法步驟
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