微生物挑戰試驗

第6章  微生物挑戰實驗

1. 簡介

微生物挑戰實驗已經並將繼續是確定食品是否支持腐敗微生物或病原體生長能力的一個有用工具。微生物挑戰實驗還是針對靶生物或一組靶生物具有殺傷力過程能力驗證的重要手段。通常，實驗後的目的是必然發布一個有關殺傷力過程的性能指標（例如：對發酵肉製品中大腸杆菌O157：H7減少5個對數值）。設計適當的微生物挑戰實驗將驗證具體過程是符合預定的性能指標。微生物挑戰研究的設計、實施和評估是一個複雜的任務，取決於相關的產品是如何開發、製造、包裝、交付、製備和消費等因素。微生物學家必須考慮前述的相關因素，並設計一項食品安全評估最佳的方案。未能考慮特定的產品和環境因素的實驗方案，會導致有缺陷的結論。

微生物挑戰實驗對確定一些冷藏或室溫保存的食品潛在貨架壽命是有用的。確定挑戰實驗是否適當或有用必須考慮的因素：如產品支持腐敗微生物或病原體生長的可能性，或之前對產品的認知。例如：對冷凍食品進行挑戰實驗是沒有意義的，因為其在合適的儲存條件下不支持微生物生長；而對於罐頭食品進行挑戰實驗來反推商業無菌是特別有用的。但是，以罐頭食品為例，它或許適於作為過程驗證的部分方案來進行接種組的研究。對於支持病原微生物生長的食品，在冷藏、溫度回升或處於環境溫度下時，則易於受到微生物生長的危害，進行微生物挑戰實驗是非常有用的。

在進行微生物挑戰實驗時，許多因素必須考慮(Vestergaard 2001)。這包括：1）適當的病原體或替代物的選擇， 2）挑戰接種的水平，3）接種物製備和接種的方法，4）實驗的持續時間，5）配方的因素和儲存條件， 6）樣品分析。數據的解析和合格/不合格的標準是評估食品安全是否需要控製時間/溫度的關鍵。

而微生物挑戰實驗對確定產品配方是否能抑製產品潛在腐敗是有用的，本章其餘部分的討論將側重於對相關的食品病原體通過控製時間/溫度以保障食品安全。

2. 挑戰實驗用微生物的選擇

表6-1列出了用於各種類型食品挑戰實驗用的一些病原體(Vestergaard 2001)。食品配方知識和食品的曆史（例如：聯想到已知的疾病暴發和/或潛在的增生證據）對選擇適當的挑戰病原體時是必不可少的。例如：某些氣調包裝（MAP）的產品要關注肉毒梭菌，在低AW的產品很少有競爭力的微生物，就需要關注金黃色葡萄球菌。

理想的挑戰實驗用微生物的是那些先前已經從類似配方食品中分離出來的。此外，還應包括已知的食源性疾病暴發的病原體，以確保配方健全到足以抑製這些微生物為宜。

挑戰實驗應包括目標致病菌多個特定的菌株。為了說明潛在的菌株變化，用“雞尾酒”或多種菌株的混合物挑戰食品配方是一種典型實驗。在一個挑戰實驗中目標致病菌用5個或更多的菌株是不尋常的。例如：肉毒杆菌挑戰實驗通常包括幾種菌株為蛋白水解A和B型，以及代表非蛋白水解菌株（如果適用）。具有明確良好特征的單菌株用於篩選產品配方挑戰實驗與過去那些已被自然廣泛運用多菌株挑戰實驗相似。

在此之前進行的挑戰實驗，相互對立的菌株應進行篩選確定。李斯特菌的某些菌株之間的拮抗作用已有報道，肉毒梭菌的某些菌株與產細菌素的乳酸菌之間也一樣有拮抗作用。如果這些不兼容是一個“雞尾酒”挑戰實驗的一部分時，那麽錯誤的結果可能會接踵而至。

同樣重要的是在標準的條件與規範下培育和製備挑戰懸浮液。用於增殖挑戰微生物的培養溫度和產品儲存溫度的改變已經顯示出改變挑戰實驗自身（1991 Curiale）的滯後期長度。在接種前必須考慮到挑戰用懸浮液要適用食品配方的環境。例如：當接種到酸性食品，在接種前大腸杆菌O157：H7細胞或沙門氏菌細胞耐酸性如何會極大地影響它們的生存能力。

最後，使用基因特征工具（如有的話）非常有助於菌株在挑戰實驗中的判定，這在縮短實驗時間方麵是有顯著優勢的。這類工具如：基因指紋和脈衝場凝膠電泳可以幫助鑒別無論是接種的或天然存在的菌株(Farber等人2001)。挑戰用微生物也可被遺傳修飾以攜帶標記物有助於從其它菌株區分開來，並有利於在食品中檢測到它們。顯然，遺傳修飾生物體需要具有與野生型或親本菌株可比的生理特性。

對於某些應用，替代微生物可用於挑戰使用代替特定病原體。例如：它通常是不可能引入病原體進入的加工廠；因此，在這些情況下理想的方式是使用替代的微生物。一個理想的替代是靶病原體菌株，其保存所有其他特征，除了它的毒力外。然而在實踐中，許多替代物是密切相關的，但不一定是相同種類的靶病原體。傳統的例子包括使用生孢梭菌的作為肉毒杆菌的接種組研究的替代，無害李斯特菌作為單增李斯特菌的替代，大腸杆菌的通用菌株作為大腸杆菌O157：H7的替代。在其後使用中，由於大腸杆菌的通用菌株不具有大腸杆菌O157：H7相同的耐酸性水平，這點必須引起注意。因此，在一個挑戰實驗中雖然使用大腸杆菌的通用菌株可能是適合以評估高pH值食品的加熱過程或防腐體係產生的影響，但用於評估酸性食品使用這些通用菌株是不恰當的。通常，替代從一組良好表征的生物中選擇並具有以下所需屬性（IFT 2000）：

•非致病性。

•滅活特性和動力學可用於預測那些靶病原體。

•暴露在配方和/或加工參數（例如：pH穩定性、溫度敏感性、和氧耐受性）的行為類似於目標病原體。

•穩定和持續增生的特征。

•易於製備成高濃度的菌液。

•一旦製備，菌數量保持穩定直到使用。

•輕鬆找出可采用的快速、靈敏和便宜的檢測係統。

•從背景菌群中能輕鬆區分。

•模仿那些目標病原體具有的特征。

•基因穩定，在獨立的實驗室或不同的實驗時間結果可被複製。

•如果用於生產區域不會滋生為一個“腐敗”的微生物群體。

•敏感性損傷類似於目標病原體。

如果一個替代菌株用於微生物挑戰實驗，實驗之前應做的基礎工作是該菌株應具有良好的屬性。應確定屬性如以上討論的那些，並通過初步的實驗室工作證實以保證替代菌株是適合於預期的目的。僅當特定病原體因安全的原因絕對不能用於產品或人員時才使用替代。

3. 接種量

在微生物挑戰實驗中使用的接種量取決於研究的目的是否是確定產品的穩定性和保質期或驗證在旨在減少微生物數量的加工步驟。通常情況下，產品中接種量在102 - 103個細胞/克之間，以用來確定配方的微生物穩定性。其它產品更高的接種量可能是適當的。根據產品的配方，一些接種的菌株在開始適應環境的初期可能會死光。如果使用太低的接種量時，不正確的假設，會認為該產品是穩定的，事實它不是。相反，如果為此目的接種量過高，不恰當的接種量抹殺了防腐體係或抑製生長的功效，從而導致不正確的結論：配方是不穩定的。當用於驗證殺菌工序如加熱處理、高壓處理或輻照，反而，通常有必要使用高的接種量（例如：106 - 107個細胞/克產品），以表明挑戰菌株減少的程度。例如：在美國果汁加工商現在需要證明有關危險的微生物在其產品中減少5個對數值（5D性能指標）。這些對數減少驗證方案通常需要使用平板法。在枚舉法的統計限內，為了測量減少到這一水平，接種量必須至少為10 6 CFU / g。

4. 接種準備和接種方法

在微生物挑戰實驗中使用菌種的製備是整體方案的一個重要組成部分。通常情況下，使用冷藏肉湯培養或斜麵或冷凍甘油恢複後培養菌種18 - 24小時。挑戰用菌種應在培養基中能生長，並處於適於其最佳的培養條件下。在一些實驗中，具體挑戰微生物適用於特定的條件。為適應特定的食品需要進行調整。例如：在進行酸性食品的挑戰實驗前，大腸杆菌O157：H7可以使用適當的酸化劑進行酸適用。細菌孢子懸浮液可被存儲在冷藏水或冷凍甘油中。接種前將孢子懸浮液用無菌水稀釋並立即熱休克。肉毒梭菌孢子使用前應徹底清洗，以確保沒有肉毒杆菌毒素被帶入進行挑戰實驗的產品中，並且，如果可能的話，孢子應在食物中熱休克以進行研究。挑戰混懸液定量計數，通過挑戰產品中目標接種物的稀釋來計算。當使用某些病原體進行挑戰實驗時，應采用適當的程序和防護設施。

在進行微生物挑戰實驗時接種的方法是另一個非常重要的考慮因素。經受挑戰時必須盡一切努力不改變產品配方的關鍵參數。有各種接種方法，可以根據受到挑戰的產品類型來采用。在含水的液體基質如調味汁和鹵汁具有高aw（> 0.96），所麵臨的挑戰接種物可被直接接種到產品中混合，用最小量的無菌水或緩衝液作為載體。在食品中添加使用稀釋液調整到產品的大致aw的保濕劑，以最大限度地減少影響食品aw 導致錯誤結果的可能性。在實驗中，其中的濕度水平是實驗變量之一，接種物懸浮在水中或液體中用於調節配方的水分含量。對於間歇式接種，所述的接種物可直接加入到混合缽或容器中的產品中。對於獨立包裝或袋式類型應用，接種物可以使用無菌注射器通過無菌方式注入含有橡膠隔膜的包裝壁內。對於aw > 0.96的固體基質，如煮過的麵或肉表麵，一個替代注射器的方法可以是使用一種霧化器。懸浮於無菌水或緩衝液中的接種物用噴霧器噴灑，將其噴到顆粒產品內或產品的表麵。噴撒應在排氣罩下來完成，或使用其他保護裝置，以避免產生的致病菌導致人員的安全問題。在所有這些應用，應使用最小量的水或緩衝液應用於懸浮接種物。接種物也可以使用一個絨墊、畫墊或類似的纖維布按提供的方法來校準，並以最小的濕氣轉移再現接種物水平。應做基礎分析以確保配方的aw或水分含量接種後不改變。對aw <0.92的產品或組份可以用霧化器方法用最小體積的水或緩衝液來接種。產品應始終進行檢查，再次強調以確保最終產品aw或水分含量沒有被改變。簡要：一些產品在最終包裝前需要有一個接種後的幹燥期。作為選擇，它們可以接種已懸浮於載體水或緩衝液中挑戰生物添加到無菌砂、麵粉或粉末形式的產品（例如：幹燥麵食），並使其幹燥。凍幹培養物也可用於某些應用。接種的可行性和增殖水平應提前研究確定。將製備的幹燥接種物無菌添加到測試產品，為均勻分布接種物應搖動或徹底攪拌。

應接種足夠的產品保障每次采樣時至少重複三次，以獲得一個全麵的挑戰實驗。在某些情況下，如在一些再驗證實驗和未接種的對照樣品，重複進行的次數可以減少。

5. 實驗持續時間

保守的微生物挑戰實驗至少在產品期望的保質期內進行。更多期待的是，用一個完整的預期望保質期加上超出預期保質期的一個餘量的產品進行挑戰實驗；如果用戶將持有並消費超出其預期保質期的產品，因為通過實驗確定其會發生什麽，這點非常重要。一些管理機構要求至少在預期的保質期數據上加上至少三分之一。

影響挑戰實驗持續時間的另一個考慮的因素是產品儲存的溫度。在目標的儲存溫度下冷藏產品其整個保質期均可作挑戰實驗，但濫用溫度條件下，他們通常持有較短時間。

在某些食品服務場所，為方便而將特定冷藏要求食品保存在保質期更短的室溫下。例如：一些快餐操作為方便製定一個8小時在室溫下存放幹酪片的時間。當加工熱三明治時，這會使得奶酪會軟和融化得更快。然而，由於餐廳操作時的交叉汙染，病原體可能存在於幹酪片中；因此挑戰實驗將需要提供證據表明這種做法是安全的。如果餐廳一班次想保存幹酪片在室溫下達8小時，挑戰實驗的持續時間至少應為12小時。如果通過餐廳操作造成幹酪片交叉汙染，進行該挑戰實驗是為確認病原體的快速增殖不會發生。

因為可能在某些產品會發生接種病菌的亞致死，還希望產品的測試顯著超出其整個保質期。在此接種物可能無法培養，這會導致長的滯後期；但隨著時間的推移，少數損傷的細胞在產品中又恢複生長。這種反彈或“鳳凰涅槃”現象，已經在多項產品中觀察到(Jay 1996)。如果產品不是在至少整個保質期內測試，有可能錯過在保質期後挑戰生物體的複蘇和後續生長。

測試的頻率由微生物挑戰實驗的持續時間所約束。為了接種操作有良好的代表性，理想情況在保質期內至少有5-7個數據點。通常情況下，如果保質期的單位是天，測試的頻率如果不是每天多次應至少是每天。如果保質期的單位是幾個星期或幾個月，測試頻率一般不少於每周一次。實驗首次應該是“零時間”測試，即分析產品接種後就開始測試。對於某些類型的產品，它也可能希望允許有一個平衡期讓接種物適應測試前的產品。在挑戰實驗早期（即：在最初幾天或一周）可能需要更頻繁地測試（例如：每天或每天多次），然後以較長的時間間隔降低測試的頻率。

6.配方因素和儲存條件

當評估配方時，了解控製微生物穩定性的關鍵參數的範圍是很重要的。內在因素，例如：pH、aw或防腐水平是防止病原體的生長或防止腐敗的關鍵，將影響到預期保質期內產品的安全性。因此，重要的是要在最壞的條件下測試配方中單獨和/或組合的每個關鍵變量。例如：如果目標pH值是4.8±0.2和在工序能力容許範圍內，在該範圍內高一端（即，pH值5.0）的挑戰產物是重要。同樣，如果山梨酸的用量為0.15±0.05％的水平，該挑戰產品應為0.10％的低濃度。這個建議，以確保挑戰實驗覆蓋了對配方中的每個關鍵因素過程能力的範圍。相關的固有性質，如pH值、aw和滲透壓每次實驗應該記錄以供將來比較和參考。

試驗樣品最好應存儲在用於市場銷售的相同包裝內。如果商品是真空或MAP包裝，那麽在微生物挑戰實驗中使用的樣品應使用相同的包裝袋在相同的條件下進行包裝。

在微生物挑戰實驗中使用的儲存溫度應包括產品在儲存和銷售過程中典型的溫度範圍。一個冷藏產品，可能會處在一個差的溫度下，那麽應在代表差的溫度條件下受到挑戰。產品可能會處於高濕度環境下，也應在此條件下挑戰（Notermans和他人，1993）。有些挑戰實驗可能將溫度循環包含到方案中。例如：製造商在產品部分保質期內可以給產品在一個良好控製的冷藏條件下，在此之後，產品使用前和使用過程中可能隨即遭受到高溫。

7.樣品分析

在微生物挑戰實驗中，要列出在每個采樣點活的挑戰微生物典型水平。通常，在每個時間點理想情況是至少應有一式兩份、最好一式三份的樣品進行分析。在需要較高水平的確定性情況下，應使用一式更多份樣品或重複進行實驗。選擇常見的培養基和培養方法（例如：直接平板接種MPN）依賴於在實驗中使用的病原體或替代微生物物的類型。如果產品沒有大量的背景微生物，可使用非選擇性培養基直接用於增殖。在使用產毒素微生物情況下（例如：金黃色葡萄球菌或肉毒梭菌），使用大多數現行的驗證方法在每個時間點應進行適當的毒素測試。可能並不需要在實驗的每個時間點都進行毒素水平測試，但在整個產品預期的保質期間要規劃較短的時間間隔來進行較多次測試，以確定保質期是否可以接受。在適當情況下，複蘇方法可避免產生錯誤的結果。

謹慎地分析產品，包括未接種的對照樣品，在每個或選定的采樣點來研究看背景菌群的行為對產品保質期的影響。例如：如果一個產品具有較高的背景菌群，它可能抑製挑戰接種物的生長。因為病原體增殖之前的產品變質在一些情況下是有益的、期望的。在其他情況下，背景微生物可能並不普遍存在，會導致一個潛在的安全錯覺。此外，在某些情況下，隨著時間的推移背景微生物可以改變產品中配方的參數有利於或抑製接種物的生長（例如：黴菌可提高產物的pH；乳酸菌能夠降低產品的pH）。

同樣重要的是在保質期跟蹤產品的相關的物理化學參數，看看它們是如何改變和影響病原體的行為。了解怎樣的因素如aw、水分、滲透壓、pH值、MAP氣體濃度、防腐劑水平和其他變量的行為對產品保質期的影響是認知產品微生物穩定性的關鍵。

8.數據解讀

一旦微生物挑戰實驗完成後，應分析數據看病原體隨時間變化如何表現。數據的趨勢分析和適當的圖形繪製（即，半對數圖）將顯示隨著時間的變化挑戰生物是否死亡、保持穩定或數量增加。對於產毒素的病原體，設定的挑戰期間應無毒素被檢測到。結合背景微生物及相關的理化數據與每個時間點定量接種數據，這樣在配方的微生物學穩定性評價上具有一個有力的證據和廣泛的代表性。根據這些數據以形成或調整產品配方，使得在合理的保質期內病原體不易生長。

當使用微生物挑戰實驗，作為一個過程驗證方案的一部分，數據的分析顯示過程是否能夠達到致死所需的水平（即，符合預先確定的能力標準）。為了滿足致死要求，如果必要的話可基於這些信息進行過程調整。

微生物挑戰實驗的數據可以用於開發微生物預測模型或驗證現有的過程。預測模型是基於計算機為基礎的方案來模擬或預測配方在特定條件下微生物將怎樣表現（例如：pH值、aw、水分、鹽和防腐劑）。微生物挑戰實驗既用來產生這些類型的以實驗為依據的模型，也用於驗證其適用性。

總體而言，精心設計的挑戰實驗可以提供一種食品配方的微生物安全性和穩定性的關鍵信息。驗證一個過程關鍵殺菌能力或微生物控製點其也是非常有價值的。挑戰研究非常有助於確定食品是否需要在其整個保質期進行溫度控製，或者在其全部或部分保質期內它是否可以保存在室溫下。

9.實驗通過/失敗的標準

選擇微生物用於挑戰實驗和/或挑戰模型取決於通過商業經驗所獲得的知識和/或考慮食品的流行病學資料或由於病原體生長導致類似食品可能產生的危害。另外，產品固有屬性（例如：pH值、水活度、和防腐劑）和外在屬性（例如：氣體、溫度和工序）也應該加以考慮。每種微生物的危險特性隨著顯著的增殖而不同。例如：傳染性病原體的生長應當保持控製，多數情況下隻有經過大量增殖才會產生毒素而導致危害。在適當控製的情況下，產毒微生物的生長並不能導致健康危險，但將要產毒。

經過小組的推薦、合理的選擇和增殖限評估後，下麵所列微生物可用於微生物挑戰實驗。

為了安全，對於產毒黴菌如曲黴屬、青黴屬和鐮刀菌需要控製時間/溫度，因黴菌變質的食品可以辨識以防止被食用，所以不推薦用於挑戰研究。 

蠟樣芽胞杆菌：不能形成毒素是選擇它的關鍵。由於毒素測量是困難的，因此需要控製時間/溫度以達成接種水平3個對數值內的增殖。這種增殖極限確定是基於以下情況：

•  蠟樣芽孢杆菌的典型初始水平較低；因此，基於文獻中1000CFU/g是一個保守的初始水平。

•  菌群數達到>106 CFU/g的水平，會產生危害健康的毒素（2001年FDA）。

•  蠟樣芽孢杆菌的致吐毒素具有熱穩定性；因此，消減是不可能的。

其他注意事項：

•  蠟狀芽孢杆菌孢子對熱都相對敏感。用於麵包產品烘焙可能會殺滅其在麵粉中低水平存在（Kaur 1986）；然而，已經報道在南瓜派中發現其不尋常的高耐熱性（Wyatt and Guy 1981）。對特定產品應該進行蠟樣芽孢杆菌生存潛力的評估。

•  曆史上蠟樣芽胞杆菌食源性疾病與米飯和土豆有關聯，因此含米飯或土豆的產品應評估時間/溫度的控製要求。

彎曲杆菌：不推薦用於挑戰實驗，因為其它微生物如沙門氏菌與其有類似的汙染路徑，而且更容易培養，也不需要複雜的營養物。此外，彎曲杆菌最低生長溫度32℃（90°F）和水分活度0.98，使它不太可能成為挑戰使用的候選對象。

肉毒杆菌：推薦的要求在目前的方法下毒素不可以形成。其他注意事項：對特定的熟製品要適當考慮肉毒梭菌，尤其是MAP包裝產生的無氧和微氧條件下的產品；如浸油食品和焙烤馬鈴薯都曾暴發過此類食源性疾病。

產氣莢膜梭菌：一個 3個對數值的增殖基於下列因素：

•  雖然其他產品可能含有存活的孢子，與產氣莢膜梭菌相關的主要是肉禽製品，包括醬和調味肉汁。依據食品法典大部分生鮮產品要求熟製。

•  肉禽製品內的產氣莢膜梭菌營養細胞很容易被烹調殺滅，而孢子由於形成條件苛刻通常含量較低。在平板上培養一個最差的情況下初始水平為100CFU/ g。增殖到> 105CFU / g會導致食源性疾病；因此為控製危害增殖不能超過3個對數值。

腸出血性大腸杆菌：如果預測病原體增殖用模型程序，因該微生物的感染性應保持儲存的時間/溫度條件使腸出血大腸杆菌在遲滯期。然而，如果用於實驗室挑戰實驗時， <1個對數值的漸進生長作為定量方法自身的變異指示增殖已被控製。

李斯特氏菌：最近的風險評估（FDA / USDA 2001）表明，較低水平的單增李斯特氏菌對公眾健康呈現低風險。認識到這一點，一些國家如：加拿大和德國建立了允許這種微生物在某些即食食品中低水平存在，但不許增殖到很高的水平。然而，在美國對這些類型的食品尚未建立一個李斯特氏菌限量。人們還認識到，支持微生物生長的那些產品呈現的風險增加。食用時100 CFU / g的單增李斯特氏菌限量可滿足保護消費者一個可接受的水平（Ross and others 2000）。然而，數據不足以確定最壞情況下該菌存在的通常初始水平。總體而言，該小組得出的結論是李斯特氏菌1個對數值的增長控製水平是適當的。這個水平基於枚舉技術的變異，代表的觀點是該菌高水平的增殖表明會危害到公眾健康時必須加以控製。

沙門氏菌：驗證恰當地病原體生長模型程序可用於核實沙門氏菌屬處在遲滯期內。否則，同腸出血性大腸杆菌一樣增殖量應被限製在<1個對數值內。

誌賀氏菌：誌賀氏菌不推薦用於挑戰實驗，因為它與沙門氏菌屬具有相同的潛在來源，並具有苛刻的生長和生存條件。

金黃色葡萄球菌：評估實驗用的時間/溫度應不產生可檢測到的毒素。目前用於毒素檢測的方法和測定特定毒素的含量同肉毒梭菌一樣。采用限製增殖<3個對數值來替代毒素測試。這個限製的生長水平是基於初始菌群為1000CFU/ g和最小需要10 6 CFU / g才產生毒素。

其他注意事項：挑戰實驗用金黃色葡萄球菌是適合的，因為其作為食源性疾病獲得廣泛地研究。金黃色葡萄球菌不適於與其他微生物競爭；因此，當食品中含有其他高濃度的微生物時，其不適於作挑戰實驗，如生菜或經過發酵的食品。

弧菌：驗證恰當地病原體生長模型程序可用於核實弧菌處在遲滯期內。否則，同大腸杆菌一樣增殖量應被限製在<1個對數值內。

副溶血性弧菌：對於海洋食品挑戰實驗可以用副溶血性弧菌替代其他弧菌。應當指出的是大多數魚類高度易腐爛，因此控製溫度是防止變質的原因。

小腸結腸炎耶爾森菌：不推薦用於沙門氏菌屬的挑戰實驗。小腸結腸炎耶爾森菌和沙門氏菌具有相似的來源，而沙門氏菌更容易培養。

表6-1 各種食品挑戰實驗中可以考慮采用的病原體

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